A gene coding for penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC14945 was cloned into Escherichia coli HB101 by inserting PstI -generated DNA fragments into the PstI site of pBR322. Recombinant clones were screened for the clear halo forming activity on the lawn of Staphylococcus aureus ATCC6538P using the enzymatic acylating reaction of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7ADCA) and D-($\alpha$)-phenylglycine methylester. From PstI-generated 17.6 kb DNA fragment, the gene coding for penicillin G acylase was localized in 2.8 kb insert DNA into pUC19 by a series of subcloning experiments. By analyzing the nucleotide sequence, the open reading frame, 1,812 bases long, was found. the polypeptide encoded by the open reading frame would be composed of 604 amino acid residues and have a molecular weight of 61,623 as calculated from the predicted amino acid composition. Upstream from ATG of penicillin G acylase gene there was a putative ribosome binding site, Shine-Dalgarno sequence. The promoter-like structure, -10 and -35 regions, which may function as promoter sequence in E. coli and vegetative Bacillus subtillis were followed by the coding sequence of penicillin G acylase gene. Following the stop coden, TAG, a structure reminiscent of the E. cili rho independent transcription terminator was present. The G+C content of the coding sequence was found to be 37.4%. When the penicillin G acylase gene was transferred into B. subtills the enzyme was produced more than 10-fold higher level compared with B. megaterium and mostly secreted into the cultured broth. The penicillin G acylase protein produced by B. subtilis harboring pUBC73 was concentrated from the cultured broth using Celite and purified to homogeneity by CM-Sepharose and DEAE-Sepharose columns. The purified protein was shown a single protein band on a 10% SDS-polyacrylamide gel and the relative molecular weight of the subunit was 59,000. The native molecular weight was estimated to be 120,000 by gel filtration chromatography on Sephacryl S-200 column, indicating that the enzyme consists of two identical subunits. The enzyme activity was strongly inhibited by the low concentration of phenylmethanesulfonylfluoride. This observation indicated the probable involvement of serine residue at the active site of the enzyme. The enzyme effectively deacylated penicillin G, cephalothin, cefamandole, cephaloridine, cephalexin, cephradine and ampicillin. This enzyme, however, could not hydrolyze penicillin N, cephapirin, cefotaxime or cephalosporin C. The enzyme also catalyzed the acylating reactions of 7ADCA and 7ACA for PGM to produce cephalexin and cephaloglycin, respectively. The rates of the acylation reacting reactions were fairly remarkable and closely related to that of deacylating reactions.
Bacillus megaterium ATCC1494 균주로 부터 penicillin G acylase 에 대한 유전자를 산탄식 방법으로 Escherichia coli HB101 에 pRB322 유전자 운반체의 PstI 부위에 클로닝하였다. 재조합 균주들은 효소에 의한 7-aminodeacetoxy cephalosporanic acid (7ADCA) 에 phenylglycine methylester (PGM) 를 아실화 하는 능력을 이용하여 Staphylococcus aureus ATCC6538P 가 깔려 있는 곳에서 성장 저지환을 형성하는 지의 여부로 스크리닝 하였다. 처음에 얻은 17.6 kb 염색체 절편으로 부터, penicillin G acylase 유전자를 일련의 유전자 조작을 통해 pUC19 에 2.8 kb 의 염색체 절편으로 그의 크기를 줄였다. Penicillin G acylase 유전자는 번역 개시 코돈인 ATG 에서 시작하여 종결 코돈인 TAG 앞부분까지 1,812 개의 염기로 이루어 졌음이 DNA 염기 분석 결과로 밝혀 졌다. 1,812 개의 염기로 이루어진 open reading frame 에 의해서 604 개의 아미노산 잔기들로 이루어진 단백질이 만들어지며 이 단백질의 분자량은 61,623 이다. ATG 앞쪽에는 리보오솜 결합 부위, 즉 Shine-Dalgarno 부분이 존재하며, E. coli 와 생장 중에 있는 (vegetative) Bacillus subtilis 에서 promoter 로 작용할 것으로 믿어지는 구조 (-10 과 -35 지역)가 있었다. 이 유전자 내의 구아닌과 시토신의 함량은 37.4% 이었다.
Penicillin G acylase 유전자를 B. subtilis 로 옮긴 결과 효소는 B. megaterium 에 비해 10배 이상 많이 만들어졌으며 그의 대부분이 세포 밖으로 배출되었다. pUBC73 재조합 플라스미드를 가진 B. subtilis 에서 만들어진 penicillin G acylase 단백질을 배양액으로부터 Celite 를 이용해 농축하고 CM-Sepharose 와 DEAE-Sepharose 판 크로마토그래피를 통해 순수하게 분리되었다. 분리된 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel 에서 하나의 밴드로 나타났으며 그 단위체의 상대적인 분자량은 59,000 이었다. Sephacryl S-200 관을 이용한 gel filtration 크로마토그래피에서 활성이 있는 효소의 분자량은 120,000 이었고 이들 결과를 종합하면 이 효소는 두개의 동일한 단위체로 이루어졌음이 밝혀졌다. 이 효소는 낮은 농도의 phenylmethane sulfonylfluoride 에 의해 그의 활성이 저해되었다. 그러므로 세린 잔기가 효소의 활성 부위에 중요한 역할을 할 것으로 생각되었다. 이 효소는 페니실린 G, 세팔로틴, 세파만돌, 세팔로리딘, 세팔로글라이신, 세팔렉신, 세프라틴과 앰피실린을 효과적으로 탈아실화 할 수 있다. 그러나 이 효소에 의해서 페니실린 N, 세파피린, 세포탁심 또는 세팔로스포린 C가 가수분해되지 않았다. 이 효소는 또한 7ADCA 와 7-aminocephalosporanic acid (7ACA) 를 PGM 으로 아실화하여 각각 세팔렉신과 세팔로글라이신을 만드는 반응을 촉매할 수 있다. 아실화 반응 속도는 높은 편이며 탈아실화 반응 속도와 밀접한 관계를 유지하는 것으로 결과가 나타났다.
