Enzymatic synthesis of medium chain glycerides (MCGs) was studied by using capric acid (decanoic acid) and glycerol as the substrates for an immobilized lipase (Lipozyme). Quantitative analysis of the reaction mixture was conducted by using a reverse phase HPLC, which enabled the exact tracing of the glyceride synthesis. The esterification activity of Lipozyme was determined at 40℃ in an open batch reactor. The synthetic activity for the capric glyceride was about 400 units per gram of Lipozyme where one unit is defined as one unit is defined as one μ Imole of fatty acid consumed (transformed into glycerides) per minute, while the activity for the oleic glyceride was about 200 units per gram of Lipozyme. Maximum initial reaction rate was obtained at 50℃ for capric and 60℃ for oleic glyceride synthesis. The time courses of the capric glyceride synthesis were analyzed in terms of different molar ratios, from which we infer that this enzyme is 1,3-specific, but not absolute, in this esterification reaction. The final conversion was greatly influenced by various water removing methods, among which the cold trap method resulted in a noticeable improvement. Dehydrated Lipozyme was prepared by storing it in the $P_2O_5$ desuccator for 4 weeks at room temperature. When we compared the esterification activity of dehydrated Lipozyme with that of intact one, the dehydrated Lipozyme did not show any activity during the first 4 hrs, but after this period, reaction proceeded at a similar rate compared to intact one, which implies that the dehydrated one can retain original activity but a certain amount of water is required for its catalytic activity.
For the study of reaction kinetics, dynamic analysis was conducted. As this lipase shows 1,3specificity, a simple consecutive reaction model was suggested and a set of linear differential equations was developed. From the time course of the closed batch reaction, the kinetic constants were estimated by solving this simultaneous equations with Gaussian elimination method. When the kinetic constants were re-substituted into the differential equations, the equations became a simultaneous. nonlinear, ordinary differential equations with known coefficients which is classified as the initial value problem. These equations can be solved numerically by using 4th order Runge-Kutta method with a personal computer. Simulation works have been conducted successfully, while varying the reaction conditions such as different molar ratios of substrates in a closed reactor, and an open reactor instead of a closed one.
고정화 리파제를 이용하여, 별도의 용매가 없는 상태에서, 중쇄지방산인 capric acid ( decanoic acid ) 와 Glycerol 을 기질로 하여 중쇄글리세리드를 합성하였다. 사용한 고정화 리파제는 Novo 사 제품인 Lipozyme IM-20 으로서, 이는 Rhizomucor miehei 로 부터 얻어진 리파제를 약음이온 교환수지에 고정화시킨 것이다. 이 고정화 리파제는 1,3- 위치 특이성을 가진 것으로 알려져 있고, 수분을 약 10 % 정도 함유한 것이다. 본 반응계에서의 중쇄글리세리드 합성역가를, 40℃에서 capric acid 와 Glycerol 의 몰비율이 3 : 1 인 Batch Reactor 에서 capric acid 가 소모되는 초기속도로 정의하였으며, 동 조건하에서 약 400 unit/g 이었다. 장쇄지방산인 Oleic acid를 비교대상으로 하였으며, 같은 조건에서의 그 합성역가는 약 200 unit/g 이었다.
두 지방산을 이용한 글리세리드 합성에 미치는 온도의 영향을 조사해 본 바, capric acid 의 경우에는 50℃ 에서, 그리고 Oleic acid 의 경우에는 60℃ 에서 최고 초기 반응속도를 나타내었다. 글리세리드 합성의 Kinetics 를 조사하기 위하여, 지방산과 그의 글리세리드의 혼합물을 분리하는 HPLC 조건을 개발하였다. HPLC Column 은 Radial Pak Novapak $C_18$ ( 4 um particle, 8 mmID x 10 cm ) 을 사용하였으며, radial compression 장치인 Z-module 에 장착하여 사용하였다. Capric 의 경우에는 RI detector 를, 그리고 oleic 의 경우에는 UV detector ( 214 nm ) 를 이용하였다. 이를 통하여 합성 반응의 자세한 진행과정을 확인할 수 있었다. 한편, capric acid 와 Glycerol 의 몰비율을 다르게 하여 반응시키고, 그 반응과정을 분석하므로써, 기질의 몰비율을 조절하여, 원하는 글리세리드의 함량이 높은 반응혼합물을 얻을 수 있었다. 합성반응은 가수분해반응의 역반응이므로, 반응계내의 수분의 함량이 매우 중요할 것으로 생각되어, 먼저 고정화효소 자체의 수분함유량을 조사한 결과 약 10.5 % wt 이었으며, 이것과 $P_2O_5$ 데시케이터에서 완전히 건조시킨 Lipozyme 의 반응 역가를 비교해본 결과, 건조된 것은 일정시간 동안 반응이 일어나지 않다가 어느 정도의 수분이 형성된 다음부터는 10 % 의 수분이 함유된 것과 거의 같은 정도의 합성역가를 나타내었다. 다음으로는, 반응계내에서 생성된 수분을 제거하는 방법에 따른 합성정도를 비교하였다. 밀폐식 반응기, 개방식 반응기 및 진공하에서 Cold Trap 을 이용하여 수분을 제거하는 방식등을 적용하였는 바, 밀폐식에서는 40℃에서 약 50 %의 전환율을 보인 반면, 개방식 및 Cold Trap 방식에서는 반응이 상당시간 경과한 후 약 90 % 이상의 최종 전환율을 나타내었다. 특히 cold trap 을 적용한 방법에서는 개방식의 경우에 비하여 40℃ 에서, capric 의 경우에는 약 15 %, oleic 의 경우에는 약 20 % 의 최종 전환율의 상승을 보여 주었다.
한편 Batch Reactor 에서는 고정화리파제가 잘게 부수어져, 반응 후기에서는 거의 paste 상태가 되어, 재이용이 불가능하였으므로, Loop Reactor 를 고안하였다. 기질 저장조로부터 기질을 Pumping하여 Column 에 충진된 Lipozyme 층을 빠른 유속으로 통과시키고, 그 배출액은 다시 저장조로 돌아오며, 저장조에서는 건조공기를 bubbling하여, 생성되는 수분을 연속적으로 제거하였다. 이러한 Loop Reactor 를 이용하므로써, 고정화리파제를 효율적으로 사용할 수 있었다.
반응 kinetics 를 조사하기 위하여 dynamic analysis (동적 해석) 을 수행하였다. Lipozyme 이 1,3-specific 리파제임을 가정하고, 그에 적합한 반응 model을 제시하였다. 완전밀폐식 반응기에서의 반응을 HPLC 로 분석하여, 그 반응 과정에서부터, 반응 속도상수를 도출하고, 그 반응속도상수를 다시 대입한 연립미분방정식을 Runge-Kutta Method 로 풀어 simulate 한 결과, 여러 반응 조건에서도 훌륭하게 일치함을 알 수 있었다. 수분이 연속적으로 제거되는 open system 에서는 반응계의 수분함량을 동적으로 표현하기 어렵다. 반응 도중의 수분 함량을 측정 하기 위하여 Karl Fisher titration 을 이용, 연속적인 수분 함량을 측정하고, 그 time course 를 가장 잘 따르는 numerical solution 을 역으로 구함으로써, open system 에서의 simulation 이 가능하였다. 이것을 이용하여 simulation 해 본 결과 실험 결과와 상당히 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 그러나, 몰비율이 1:1 인 경우에는 상당히 벗어 나는 결과를 나타내었는 바, 이는 1:1 인 경우의 반응액이 매우 고점도 상태로 실제 반응에서 적절한 교반을 할 수 없었던 것이 그 원인이라고 생각된다.
이와 같은 동적해석을 통하여 다른 반응 조건에서의 반응을 휼륭히 예측할 수 있었으며, 이러한 결과를 연속식 반응장치 설계에 긴요하게 응용할 수 있으리라 생각한다.
