A gene encoding allosteric L(+)-lactate dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) of $\underline{Lactobacillus}$ $\underline{casei}$ ATCC393 was cloned in $\underline{Escherichia}$ $\underline{coli}$ using oligonucleotide probes synthesized based on the previously determined amino acid sequence (R.Hensel, U.Mayr, and C.Y.Yang, Eur. J. Biochem., 134, 503-511, 1983). A complete nucleotide sequence of the gene was determined by the dideoxynucleotide method. The open reading frame comprising 981 base pairs (bp) started with a GTG and stopped with a TAA codon. The translated amino acid sequence agreed well with the previously determined amino acid sequence except for four exchanges at positions 38, 133, 281 and 285 as well as an inversion at 102 and 103. The inversion resulted in a replacement of Lys with Gln at position 102, which is highly conserved and responsible for the substrate discrimination.
Sl nuclease mapping experiment revealed a couple of sequences for -35 and -10 region as CTGTCA and GATAAT, respectively, with a spacing of 18 nucleotides. The sequences of ribosome binding site were also found 10 bp upstream from the start codon as AGGA and AGAAAGGA identical to those of $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ and $\underline{B.}$ $\underline{subtilis}$, respectively.
Downstream from the TAA stop codon, there was a structure resembling $\rho$ -independent transcription terminator. The free energy of formation for the structure was -19.4 kcal.
The allosteric LDH activity in $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ was consistent throughout growth phase showing 12.7 U/mg protein when expressed solely by its own promoter and 123 U/mg protein when effected by the $\underline{lac}$ promoter of pUC19.
In contrast, when transformed with the cloned $\underline{ldh}$ gene, $\underline{B.}$ $\underline{subtilis}$ produced the allosteric LDH in a growth-associated pattern as also shown in $\underline{L.}$ $\underline{casei}$. The maximum specific activity was, however, 208 U/mg protein, which was approximately 16 times higher than those in $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ and $\underline{L.}$ $\underline{casei}$. Furthermore, the allosteric LDH produced by the cloned gene comprised up to 40\% of the total cellular protein. By the aid of high expression ability of the $\underline{ldh}$ promoter sequence in $\underline{B.}$ $\underline{subtilis}$, an attempt was made to construct an expression shuttle vector to be used in bacilli and lactobacilli.
유산간균의 일종인 $\underline{Lactobacilllus}$ $\underline{casei}$ ATCC393 으로부터 젖산탈 수소효소 (EC 1.1.1.27) 유전자를 세개의 합성 DNA probe 를 이용하여 대장균 내에서 클로닝 하였다. 그 염기서열을 분석한 결과 GTG로부터 TAA로 끝나는 구조유전자 부위를 발견하여 아미노산 서열을 추측하였다. 여기서 추측된 아미노산 서열은 이미 같은 균주에서 밝혀진 아미노산 서열과 잘 일치하였으나 38, 133, 281, 그리고 285 번 위치에서 치환이 일어났고 102, 103번 위치는 그 순서가 바뀌었다. 그 결과, $\underline{L.}$ $\underline{casei}$ 도 다른 세균들과 마찬가지로 기질특이성에 필수적인 글루타민 잔기가 102번 위치에 있음을 알았다.
Sl nuclease mapping 결과 프로모터를 이루는 -35 와 -10 부위 염기서열을 각각 CTGTCA와 GATAAT로 밝혀졌고 이들은 18개의 염기를 사이에 두고 있었다. 또한 GTG codon으로부터 10개의 염기 앞에서 대장균과 고초균에서 알려진 리보솜 결합부위 염기서열이 각각 AGGA와 AGAAAGGA로 밝혀졌다.
TAA codon 아래부위에서는 대장균의 $\rho$-independent 전사종결을 위한 구조를 갖는 염기서열이 발견되었고 그 구조 형성 자유에너지는 -19.4 kcal로 계산되었다.
이러한 염기서열을 갖는 젖산탈수소효소유전자의 발현은 대장균내에서 세포의 성장곡선에 무관하게 자체 프로모터에 의해 12.7 U/mg protein의 젖산탈수소효소 활성을 보였고, pUC19의 $\underline{lac}$ 프로모터 영향에 의해 123 U/mg protein 까지의 활성을 나타냈다.
반면, 고초균내에서는 $\underline{L.}$ $\underline{casei}$ 에서처럼 이 유전자의 발현이 세포 성장곡선과 비례하여 그 최고활성이 208 U/mg protein 까지 증폭되었으며, 이는 대장균이나 모균에서보다 16배가량 높은 활성이었으며 생산된 효소는 전체 세포단백질의 40% 가량을 차지했다. 고초균내에서의 이러한 높은 발현 능력을 이용하여 그 프로모터로써 고초균 및 유산간균에서 사용될 수 있는 유전자 발현용 벡터를 만들었다.
