All species, including microorganisms, evolve as a response to diverse environmental stress conditions. Genome permanence is maintained in these organisms to demonstrate the species-specific adaptation mechanisms towards certain conditions. In this regard, approximately a hundred discovered noncoding RNAs (ncRNAs) are believed to be responsible for the development of viability in Escherichia coli through expression in response to specific situations and regulation of target genes. In addition, DEAD-box RNA helicases, which are required mostly for RNA metabolism, but are not essential during normal cellular conditions, have been found to be essential for the regulation of cell growth under stress conditions. Although, DEAD-box RNA helicases may be related to ncRNA function, there are very few reports detailing any correlation between the two. Therefore, the effect of DEAD-box RNA helicases on the metabolism of ribosomal RNA (rRNA), a type of ncRNA, at low temperatures was analyzed. An interactome study was conducted between the ncRNAs and proteins using several screening systems. In addition, an encapsulation technique was developed and characterized using yeast for the control of cytoprotection and degradation. Finally, we attempted to characterize the regulation of RNA metabolism for cell survival in various environmental conditions.
In this thesis, the effect of DEAD-box RNA helicases (important factor for protein synthesis), which bind specifically to rRNA, was investigated during the maturation of 23S rRNA at low temperatures (22°C). Primer extension analysis revealed the accumulation of -3 and -1 pre-rRNA (expressing 3 and 1 additional nucleotides, respectively at the 5′-end compared to mature 23S rRNA) and the slow synthesis of mature 23S rRNA during the early-exponential phase of ΔdbpA, unlike that in the wild-type genome. Through the double deletion of dbpA and the genes encoding the other DEAD-box RNA helicases, DbpA was shown to more significantly regulate the maturation of 23S rRNA than other DEAD-box RNA helicases. The accumulated -3 pre-rRNA was identified to be a major component of the 70S ribosome by sucrose gradient analysis, suggesting the utilization of immature rRNA for cell survival in the absence of mature 23S rRNA (not synthesized because of the absence of DbpA at low temperatures). Furthermore, we observed alterations in microbial susceptibility towards neomycin B, which binds specifically to the H69 region in 23S rRNA or affects RNA modifications in the DbpA-joinable domain V of 23S rRNA, according to the presence or absence of DbpA. This would solve the question motivating this study, concerning the coordination between RNA modification enzymes and DEAD-box RNA helicases during rRNA maturation.
We developed a yeast three-hybrid system to conduct an interactome study between ncRNA and target biomolecules. The use of the yeast three-hybrid system for investigating the interactions between ncRNA and a protein has not been previously reported. Therefore, we initially demonstrated that this system could be used to analyze interactomes by improving each selection step in order to distinguish the false-positive clones. XylR, a DNA-binding protein, was screened as a 6S binding target. This revealed its RNA-binding ability. In addition, the presence of a xylose-dependent auto-regulatory mechanism, activated by self-binding to its own mRNA, was confirmed. Conversely, a south-northern dot-blot and northern blot were used to examine the specific protein-bound ncRNAs. Most RNA sequences were observed to bind to DEAD-box RNA helicases and RNA chaperones. The GcvB, GlmZ, and GlmY ncRNA were observed to bind strongly to RhlB and RhlE, while RyeB and OmrA ncRNA were observed to bind to Rho, a transcription termination factor. Based on this, we propose further research on the transcription termination effect of RyeB.
In addition, cytoprotection- and degradation-controllable encapsulated yeast cells were characterized, and their cell metabolism was analyzed. Encapsulated yeast was prepared using a rapid and simple technique utilizing tannic acid, a natural polyphenol, and Fe3+ ion (yeast@TA-FeIII). Cell survival was investigated during the encapsulation process, and we discovered adjustable cell division, which would help restore the status of the cell before encapsulation, by rapid degradation in a weak acid condition. The cytoprotectability of yeast@TA-FeIII was investigated against physical contact with E. coli, as well as against exposure to external stresses such as the effect of UV-C, lyticase, and silver nanoparticles. In addition, the repression of DSE2 mRNA transcription was confirmed to be caused as a result of the stress generated by sporulation-mimicking encapsulation. This implied that the cell retains its own life in order to cope with the adaptation of metabolism to specific situations.
In summary, this study proposed that DbpA RNA helicase is involved in rRNA biogenesis at low temperatures and that the premature rRNAs accumulated in the absence of the DbpA RNA helicase could be utilized for cell survival. Secondly, several screening tools were introduced and developed for the identification of ncRNA-protein interactomes. Finally, a single-cell encapsulation of yeast (yeast@TA-FeIII) was characterized, and the RNA regulation against envelope stress was analyzed. These findings could play a central role in the research concerning functions and mechanisms of cellular RNA, regulated specifically for cell maintenance under environmental stress. Furthermore, the results of these studies may contribute to the development of a novel tool for RNA-mediated analysis, which could be applied to single-cell manipulation technology.
미생물을 비롯한 각종 생물 종들은 다양한 환경에 적응하며 각각 독특한 종으로 진화해왔다. 그들은 특정 환경 요인에 적응할 수 있는 종 특이적 적응 기작을 발휘하며 게놈의 영속성을 유지한다. 이와 관련하여 대장균에서는 100여종에 이르는 small noncoding (ncRNA) 중 일부가 특정 환경에 따른 발현 및 목표 유전자 조절을 통하여 세포 생존 능력을 향상시킨다는 결과가 보고되고 있다. 더불어 대부분의 RNA 대사에 관여하고 있지만 보통의 환경에서는 필수적이지 않은 RNA 나선효소 또한 특정 환경에서 정상적인 세포 대사에 필수적으로 작용한다는 것이 밝혀지고 있다. 이는 ncRNA 발현 조절에 RNA 나선효소가 연관 되었을 가능성을 제시하지만 실제로 알려진 결과는 극히 드물다. 따라서 본 학위논문에서는 ncRNA의 한 종류인 ribosomal RNA (rRNA)의 저온 환경에서의 대사에 RNA 나선효소가 미치는 영향을 분석하고, 다양한 스크리닝 시스템을 통해 ncRNA와 단백질간의 상호작용체 연구를 진행하였다. 그리고 세포 보호와 분해가 조절 가능한 피포화 기술을 개발하고 이를 성질화 함으로써, 다양한 환경에서 세포 생존을 위한 RNA의 대사 조절 기작을 확인하였다.
먼저, 단백질 합성에 중요한 요소이자 ribosomal RNA (rRNA)에 특이적으로 결합한다고 알려진 DEAD-box RNA 나선효소 DbpA가 저온 (22 ℃)의 23S rRNA 성숙 과정에 미치는 영향을 조사하였다. 프라이머 연장 분석을 통해 성숙한 23S rRNA에 비해 5’ 말단이 각각 3nt와 1nt 만큼 미성숙 된 -3 pre-rRNA 및 -1 pre-rRNA가 dbpA 결실 균주의 지수성장기에서 야생형과는 다르게 축적되는 것뿐만 아니라 초기-지수성장기에서는 성숙된 23s rRNA가 비교적 느리게 생성되는 것을 확인하였다. 그리고 dbpA 및 다른 RNA 나선효소 유전자의 이중 결실 균주를 통해 DbpA가 나머지 RNA 나선효소와는 구별되는 단계에서 23S rRNA 성숙을 조절하고 있다는 것을 알 수 있었다. 자당 증감 분석을 통해 축적된 -3 pre-23s rRNA는 70S 리보솜에서 주요한 구성 성분을 이루고 있는 것을 확인하였고, 이는 저온 환경에서 DbpA 결실에 의해 성숙된 23S rRNA가 합성되지 못하는 경우 세포 대사를 위해 활성을 덜 가진 미성숙 형태의 rRNA가 활용된다는 것을 의미한다. 이와 더불어 23S rRNA H69에 특이적 결합을 하는 neomycin B 항생제의 민감성 변화와 함께 H69 및 DbpA가 특이적 결합을 하는 domain V에 존재하는 RNA 변형 정도의 차이를 DbpA 유무에 따라 확인함으로써, 이 연구의 시작이 되었던 rRNA 성숙 과정에서의 RNA 변형 효소와 DEAD-box RNA 나선효소 사이의 조직화에 대한 궁금증을 해결할 수 있었다.
다음으로, ncRNA와 타겟 생체분자들 사이의 알려지지 않은 상호작용체 연구를 위한 yeast three-hybrid 시스템을 향상시켜 최적화하였다. 대장균의 ncRNA와 상호작용하는 단백질을 찾기 위해 yeast three-hybrid 시스템 적용한 연구는 보고된 적이 없었는데, 본 연구에서 이 시스템의 최대 단점인 위양성군의 제거를 위한 각 선발 단계의 향상을 통해 그들의 상호작용을 분석할 수 있는 좋은 도구가 될 수 있음을 보여주었다. DNA 결합 단백질로 알려진 XylR 단백질은 6S ncRNA의 타겟으로 선정 되었으나 다른 RNA에도 결합할 수 있음이 밝혀졌고, 특히 자신의 mRNA에 결합하여 xylose에 의존적으로 단백질 발현을 자가 조절할 수 있는 기작의 존재성을 확인하였다. 역으로, 사우스-노던 닷-블랏 (south-northern dot-blot) 및 노던 블랏 (northern blot)을 통해 특정 단백질에 결합하는 ncRNA들을 확인하였다. RNA 나선효소 및 RNA 샤페론에 대체적으로 많은 RNA가 결합되어 있었고, GcvB, GlmZ 및 GlmY ncRNA가 RhlB 및 RhlE RNA 나선효소에 강한 결합력을 보였다. 전사 종결 인자인 Rho 단백질에는 RyeB 및 OmrA ncRNA가 강하게 결합되어 있는 것을 확인하였으며, 이들의 전사 종결 메커니즘을 후속으로 연구하였다.
마지막으로, 세포 보호 및 분해가 조절 가능한 피포화 효모에 대해 그 특성을 성질화하고 세포 대사에 대해 분석하였다. 폴리페놀의 한 종류인 탄닌산과 철이온(III)을 이용한 빠르고 간단한 캡슐화 기술을 도입해 효율적으로 피포화 효모를 형성시켰다 (yeast@TA-FeIII). 피포화 과정에서의 효모 생존도를 확인하였고, 약한 산성 조건에서 피포가 빠르게 분해되는 특성을 이용해 원하는 시간에 피포화 전 상태로 복구해 세포 분열을 조절할 수 있음을 밝혔다. 자외선, 은나노입자 등의 물리적 요소에 대한 세포 보호 능력을 확인함으로써 극한의 외부 환경에 노출되더라도 높은 세포 생존도를 유지하는 결과를 나타내었다. 또한 포자를 모방한 피포화에 의해 스트레스가 가해진 환경에서의 RNA를 분석하여 세포 분열에 관계된 DSE2 mRNA의 전사가 억제되고 있음을 확인하였고, 이는 효모가 특정 상황에 맞도록 대처하며 세포 생존을 유지하고 있다는 것을 의미한다.
요약하자면, 본 학위논문에서는 저온의 환경에서 RNA 나선효소가 rRNA의 대사에 필수적인 기능을 하고 있으며 RNA 나선효소가 결실된 경우, 세포 생존을 위해 미성숙한 rRNA로도 세포 대사가 가능함을 밝혔다. 더불어 효모에 대한 피포화 기술을 정립하고 성질화 하였으며, 피포화에 의한 스트레스에 대해 생존을 위한 세포의 변화된 RNA 대사를 확인하였다. 본 학위논문에서 수행된 RNA 대사 분석은 학술적인 측면에서 다양한 환경에서의 세포 생존을 위해 특별하게 발현되거나 필수적으로 요구되는 세포 내 RNA의 기능 및 조절 메커니즘 연구에 중요한 역할을 할 것이며, 응용적 측면에서도 RNA와 연관된 세포조작기술의 분석 및 응용에 새로운 가능성을 부여 할 것으로 기대된다.
