Conventional cancer treatment is dependent on the chemotherapy, surgery, radiothera-py. Cancer immunotherapy has been viewed as alternative way to overcome tumors instead of conventional therapies. Protein or peptide-based cancer vaccines in general have used to induce long-lasting antibody responses as a first line of defense system against pathogens. In contrast, antigen-specific cytotoxic T cell (CTL) responses, which are critical for immunity against tumors, has been less explored. Recently, Nanoparticle-based vaccine delivery systems have shown good efficacy for delivering antigens into professional antigen presenting cells(APCs), especially dendritic cells and subsequent dendritic cell activation to elicit adaptive immunity known as cross-presentation. Therefore maximizing the efficiency of cross-presentation is main issues for the successful design of therapeutic cancer vaccines. Here, I developed the potent vaccine delivery system based on tumor associated antigen (TAA)-coated gold nanoparticle(GNP) and its cross-presentation ability was sufficient and effective for actives the CTL responses and rejects the tumors. To demonstrate the self-adjuvanting effects of gold nanoparticles, I prepared three different sized gold-nanoparticle (5, 13, 30 nm) and figure out immune-stimulating activities in vitro and in vivo, respectively. In the final chapter, I describe combinatorial design of highly stable and immunogenic peptide capping ligands for gold nanoparticles using CALNN motif.
In chapter 2. I reported a gold nanoparticle-based therapeutic cancer vaccines against a tu-mor-associated antigen (TAA), extra domain B of fibronectin (EDB). I described the prepa-ration, characterization, and evaluation of therapeutic efficacy of the antigen-loaded GNPs. In addition, mechanism study on cross-presentation ability of the nanoparticle vaccine was also described. The EDB-loaded GNPs could effectively mediate cross-presentation of the antigen, resulting in induction of EDB-specific antibody production and cytotoxic T lym-phocytes that led to effective tumor growth inhibition in the EDB-overexpressing breast cancer model. Taken together, GNPs have potential to be used as a platform enabling effi-cient immune stimulation as well as antigen delivery to antigen presenting cells for treat-ments of cancers and chronic infections.
In chapter 3. I demonstrated that gold nanoparticles can be used as a promising tool for boosting cellular immune response based on their size and surface chemistry. Nanoparticle properties such as size, shape, surface charge and density were expected to critical de-termining factors in induction of potent CTL response. For the size dependent immuno-genicity study, sub-40nm GNPs (7, 14, 28 nm) were successfully conjugated with oval-bumin as a model antigen. Interestingly, the larger size of GNP-OVAs showed the better uptake efficiency in DC2.4 cells. In addition, in vitro pro-inflammatory study demon-strate above 14-nm size of GNP-OVAs effectively simulate RAW264.7 macrophage like cells. Next, to examine whether size of GNP-OVA affect processing and cross-presentation, I performed in vitro cross-presentation assay using DC 2.4 cells and CD8+ T cells isolated from OT-1 transgenic mice; these latter cells can recognize MHC class I epitope of OVA protein (OT-1) after it is processed and cross-presented by MHC class I on DCs. Strong cross-presentation efficacy showed in larger size of GNP-OVA (28 nm). By measuring of T cell polyfuntionality of each immunized mice model, I evaluate the critical factors and threshold of size for induction of cellular immunity. The frequencies and total numbers of splenic ova-specific CD8+ T cells were significantly enhanced in mice immunized with GNP-OVA (14, 28nm) compared with LPS-OVA immunized mice, and were comparable to that of CFA-OVA immunized groups. However, the total num-bers of splenic ova-specific CD8+ T cells in mice immunized with GNP-OVA (14, 28nm) does not statistically significant compared with GNP-OVA (7 nm) and soluble OVA. Fur-thermore, in the absence of OT-1 re-stimulation, few responding CD8+ T-cells were de-tected in 14, 28nm size if GNP-OVA groups. This background stimulation might be relat-ed to slow release of antigen from GNPs and prolonged presentation of antigens. Thus, we need further experiment to verify this possibility by in vivo cross-presentation study using CSFE-labeled OT-1 or ex vivo cross-presentation assay.
기존의 암 치료방법은 약물치료, 외과적치료, 방사선치료 등에 의존도가 높았습니다. 그러나 이러한 치료법은 정상세포까지 죽이는 부작용이 있어 대체의학으로써 암 백신에 대한 관심이 전세계적으로 높아가고 있는 추세입니다. 환자 개개인의 암에 대한 면역기능을 높여 암을 선택적으로 죽이면서 부작용을 최소화하는 것이 암 백신의 장점이지만 현재까지 개발된 암 백신은 암 환자 개개인으로부터 말초 혈액을 채취해, 체외에서 면역세포를 활성화한 후 다시 해당 암 환자의 체내로 투여하여 암세포를 제거하는 방법이 유일하며 제조 공정이 복잡하고 비용이 비싸다는 단점을 가지고 있습니다.
이러한 단점을 극복하고 실용화가 가능한 암 백신 전달체로써 금 나노입자를 도입하였습니다. 금 나노입자는 직경 10-20 나노미터 크기로써 국소림프절로 항원 전달이 용이하고, 제조공정도 매우 단순하며, 다양한 의약품을 손쉽게 금나노입자 표면에 코팅할 수 있을 뿐만 아니라 CT 이미징을 통해 백신 도달 과정의 추적이 용이하다는 장점을 가지고 있습니다. 이미 선행연구를 통해 외부 모델 항원으로 RFP(red fluorescence protein)가 컨쥬게이션된 금나노입자가 특별한 면역보조제를 함께 병용투여하지 않아도 매우 효과적으로 T 림프구의 암에 대한 공격능을 활성화시킴을 동물모델에서 확인한 바 있습니다.
먼저 2 장에서는 금 나노입자가 특별한 면역보조제와의 병용투여와 무관하게 세포 독성 T 림프구의 활성을 증가시키며 이에 따른 탁월한 항원 특이적 항암 효능을 보이는 것과 관련하여 외부 모델 항원이 아닌 실제 암 관련 항원을 도입하였을 때에도 이와 동일한 효과를 보이는가를 규명하기 위한 연구를 진행하였습니다. 대부분의 나노입자를 이용한 암 백신 연구의 경우 모델 항원으로써 외인성 항원을 도입하는 경우가 많기 때문에 실제 암 모델에서 적용 시 과대평가 되는 경우가 많습니다. 왜냐하면 실제 암 관련 항원 (Tumor associ-ated antigen, TAA)의 경우 면역 체계를 회피하는 면역 관용을 가지는 경우가 많기 때문에 암 관련 항원을 도입한 연구에서의 체내 항암 효능 평가의 성공 가능성은 매우 높지 않기 때문입니다. 본 연구에서는 실제 암 관련 항원인 Extra domin B(EDB)를 금 나노입자와 함께 섞어주어 금 나노 입자 표면과 EDB 단백질 사이에 dative thiol-gold 결합 형성을 통한 EDB/AuNP를 제조하였으며 TEM, DLS, UV-vis absorption을 통해 합성이 성공적으로 수행됨을 확인하였습니다. 암세포는 자체적으로 면역회피기능을 가지고 있기 때문에 이에 대한 치료백신으로 기능하기 위해서는 암특이적 세포독성 T 림프구의 활성화가 매우 중요합니다. 따라서 본 연구에서는 T 림프구의 활성화에 직접적으로 관여하는 항원제시세포(APC)의 교차-항원제시능(Cross-presentation activity)을 확인하기 위해 EDB/AuNP 를 수지상세포에 처리하여 ELISA를 통해 분석하였습니다. 그 결과 금나노입자가 일반적으로 백신에 많이 사용되는 면역보조제인 CFA, Alum에 비해서 현저하게 높은 교차-항원제시능을 보임을 확인하였고 이러한 결과는 실제 EDB를 발현하는 흑색종 암모델에서 암성장을 효과적으로 억제함을 증명하였습니다. 이러한 연구는 금나노 입자 표면의 항원만 바꿀 경우, 현재 임상적으로 치료가 어려운 바이러스성 질환인 C형 간염과 HIV(에이즈 바이러스)에도 응용해 사용할 수 있을 것으로 기대됩니다.
다음으로 제 3장에서는 또한, 금 나노입자 크기에 따른 세포 독성 T 림프구의 다기능성 (Poly-functionality)을 밝히기 위한 연구를 수행하였습니다. 최근 나노입자의 크기, 모양, 표면 전하 등의 특성들이 면역 체계에 미치는 영향에 대해서 많은 연구자들이 관심을 가지고 있습니다. 이미 몇몇의 연구에서 나노입자 크기에 따른 면역증강효과를 밝히는 연구를 수행한 바 있으나, 대부분의 연구가 나노에서 마이크로 수준의 넓은 범위에서의 입자 크기에 따른 면역효과를 밝히는 연구에 국한되어 있었습니다. 본 연구에서는 실제 림프관에 직접적으로 전달 될 수 있는 크기인 30-나노미터 이하의 좁은 범위 내에서 크기에 따른 면역세포의 활성화, 무엇보다 세포독성 T 림프구가 분비할 수 있는 최대 사이토카인의 개수와 종류를 비교 분석하는 poly-functionality에 대한 연구에 초점을 맞추었습니다. 먼저, 모델 항원으로써 오발부민(ovalbumin)이 코팅된 7, 14, 28 nm 크기의 금 나노입자를 합성하여 수지상세포주인 DC2.4에서 uptake 효율을 in vitro와 in vivo에서 비교한 결과 14와 28 nm 크기의 금 백신이 7 nm 에 비해 효과적으로 uptake됨을 확인할 수 있었습니다. 대식세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 분비능을 비교한 결과, 금 나노입자의 표면에 결합된 항원의 양이 높을수록 사이토카인의 분비능이 높았으나 나노입자 크기에 따른 분비능에는 차이가 없음을 증명하였습니다. 또한 DC2.4세포주에서 금 나노입자 크기에 따른 교차-항원 제시능을 평가한 결과 28 나노미터 크기의 GNP-OVA 그룹에서 매우 높은 효율로 MHC class I-SIINFEKL에 상응하는 T 세포 수용체 (TCR)를 가지는 T 림프구의 활성을 촉진 시킴을 확인할 수 있었습니다. 세포독성 T 림프구의 다기능성(Poly-functionality)을 분석하기 위해 서로 다른 크기의 GNP-OVA를 3주간 면역 후 비장에서의 T 림프구를 분리하여 세포내 사이토카인 염색법(ICS)을 통해 다양한 사이토카인의 분비능을 유세포 분석기로 확인한 결과 마찬가지로 14, 28 nm 크기의 GNP-OVA가 TNF-α, IFN-γ, CD107a, IL-2 와 같은 Th1 타입의 사이토카인을 두 개 혹은 세 개 이상 분비하는 세포 독성 T 림프구의 수가 7 nm의 GNP-OVA에 비해 높은 경향성을 보였습니다. 그러나 본 결과에서는 경향성만 입증하였으며 통계적 유의성 및 재현성을 높이기 위해 한번 더 실험을 진행해 보아야 할 것으로 생각됩니다. 현재까지의 결과로 미루어 볼 때 14, 28 nm 크기의 GNP-OVA는 7 nm 크기의 GNP-OVA에 비해 수지상세포로의 높은 uptake 효율을 보이며 이에 따라 수지상세포의 활성화를 촉진함으로써 다양한 사이토카인을 분비하는 CD8+ T 림프구의 활성을 촉진할 수 있을 것으로 사료됩니다.
