A cultured network of dissociated neurons has been considered as a valuable tool for studying the neural dynamics in the reduced scale, compared to the complicated brain or its slices. Multichannel electrophysiology has enabled the studies of neural information processing and dynamics in the cultured networks. Although the in vitro system has hinted the global properties of network functionalities, it still remains unclear how individual neurons participate in such collective dynamics due to the still complex structure of the network and limited number of sensors. Aimed at investigating the biological and functional properties of individual neurons in a simplified network, this dissertation deals with several technical issues. First, we focused on improving the micropatterning methods for engineering the micro-surface cues. Our patterning methods resolve the drawbacks of standard micro-contact printing, especially preventing roof-collapsing and creating uniform patterns. Second, the optical instrumentation and analytical methodologies based on calcium imaging were established for simultaneously monitoring neural signals at the single cellular level. The series of algorithms for automated processing and analysis of calcium imaging data are proposed with several statistical metrics to quantify the functional association of neurons in a large network. Focusing on the network-wide synchronous activity, we investigated the relation of the neuronal phenotype and its firing patterns to the global bursts of the structurally confined micro-network. We found the ordered patterns of neuronal firing and the distinct roles of neuronal types in initiating and modulating the cellular activation. Last, the micropattern designed for axon guidance was applied to construct a modular neural network with the oriented signal propagation. Using these designed circuits, we studied the relation between cellular activity patterns and the different state of network activity. This work presents that the integration of advanced technologies for surface design and optophysioloigcal recording into the in vitro culture enables the systematic studies of neural networks at the single cellular level under experimentally controlled conditions. We hope that our work will contribute to the development of an experimental network model with living cells for the potential applications of neuroscientific researches.
체외 배양된 신경네트워크는 뇌 자체나 절편에 비해 복잡도가 비교적 낮고, 단일 세포 단위의 접근이 가능하기 때문에 다양한 신경생물학 실험 모델로 널리 사용되어 왔다. 특히, 다채널전극칩과 같은 전기생리학적 신경 신호 측정 시스템과 결합하여 신경 정보 처리와 동역학에 대한 연구에도 많이 응용되고 있다. 그러나 배양된 네트워크는 수만 개 이상의 세포로 이루어져 있고, 측정 가능한 채널의 수는 한정되어 있어 네트워크의 집단적 활성과 신경세포 각각의 발화 패턴 간의 관계를 연구하기에는 제약이 있다. 이러한 기술적 한계를 극복하기 위하여, 본 학위논문에서는 미세 공정 기술과 광학적 신호 측정 및 분석 기법을 기반으로 하는 체외 신경 네트워크 모델 개발에 관한 연구 내용을 논하였다. 먼저 신경세포의 성장을 제어할 수 있는 배양 기판 미세 패터닝 기술에 관하여 다루었다. 신경세포는 주변환경에 매우 민감하게 반응하기 때문에 정밀한 제어를 위해서는 균일한 패턴을 만드는 것이 중요하다. 본 연구에서는 간단한 방법으로 아가로즈 수화젤을 미세도장 표면에 얇게 코팅함으로써 소수성인 도장 표면을 개질하여 친수성의 세포 흡착분자 전달력과 표면에 제작된 패턴의 균일도를 크게 향상시켰다. 또한, 액체 안에서 수행하는 패터닝 기술을 개발하여 기존 미세 패터닝의 패턴 설계 한계 및 결합 안정성을 개선하였다. 다음으로, 배양된 대량의 신경세포의 활성을 동시에 광학적 방법으로 측정하는 칼슘 이미징 시스템을 구축하고, 고속으로 저장되는 방대한 사진 데이터로부터 광생리학적 신경 신호를 추출하고 분석하는 여러 가지 알고리즘을 개발하였다. 이를 통해 사진 데이터로부터 신경 세포를 인식하여 각 세포의 신경 신호를 추출하고, 모델링을 통해 얻어진 칼슘 센서 반응 함수를 기반으로 각각의 신경 신호에서 잡음을 제거한 뒤 신경 신호의 발화 시점을 역추적할 수 있었다. 또한 얻어진 발화 시점 데이터로부터 동기화된 네트워크 활성을 검출하고, 짧은 시간 동안 나타나는 세포들간의 발화 순서를 분석하여 네트워크에서의 시공간적 신경세포 발화 지도를 구하였다. 이를 바탕으로 하여, 현미경 시야 내로 구획화된 수백 마이크로미터 크기의 체외 배양 신경네트워크를 구현하고, 이 단순화된 신경네트워크를 구성하는 모든 신경세포들의 생물학적 특성과 시공간적 발화 패턴이 자발적으로 발생하는 네트워크의 동기화 활성에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 그 결과, 신경세포간에 일정한 발화 순서가 존재하며, 세포의 종류에 따라 발화를 개시하거나 조절하는 서로 다른 역할을 하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 축색돌기 성장을 제어하는 마이크로 패턴을 응용하여 구획화된 신경네트워크 내부의 신호 전달 경로를 제어할 수 있는 네트워크 설계 기술에 관하여 논의하였다. 본 논문은 신경네트워크 패터닝 기술과 광생리학적 기법을 결합한 새로운 실험 플랫폼을 제안하며, 이를 통해 복잡한 신경네트워크와 이를 구성하는 신경세포간의 연결고리를 연구하기 위한 살아있는 실험 모델로서의 응용 가능성을 기대한다.
