Articular cartilage offers friction-free joint motion and weight-bearing of joints, and it is always exposed to biophysical stresses such as mechanical compression, tension, and shear. The major role of cartilage is distribution of load into joints for preventing the excessive load which may damage both the cartilage and the bone. The excessive physical stresses initiate and propagate cartilage disease such as osteoarthritis, and consequently, they lead to permanent cartilage defects. Cartilages have a limited repair capacity due to their hypo-cellular, avascular, aneural and alymphatic characteristics. Indeed, it is well-established that defected cartilages have a limited potential for regeneration, similarly due to lack of reparative cells near the defected sites. Normal chondrocytes are embedded in the cartilage matrix whose phenotypes are affected with the extracellular matrix. During subpopulation of chondrocytes in the two-dimensional (2D) monolayer culture, the chondrocytes lose intrinsic characteristics and shift to fibroblast-like cells. This change, termed dedifferentiation, results in alterations of morphology, gene expressions, and functions which are affected by various culture conditions. Especially, it is well-known that dedifferentiation of chondrocytes takes place in peripheral sites of cartilage defects. However, there has been limited research how dedifferentiated chondrocytes respond to excessive mechanical stress. In this research, we investigated passage-dependent responses of chondrocytes to excessive mechanical stress. In chapter 1, we introduced cartilage biology and mechanical environments of cartilage and chondrocytes. In chapter 2, we found that focal adhesion complex was the key regulator of dedifferentiation through the observation of phenotypic changes for subpopulation of chondrocytes. We observed significant differences in the size of focal adhesion sites during dedifferentiation of chondrocytes. The average area and length of focal adhesion were significantly increased from 0.9 to 1.4 μm2 and from 1.3 to 1.7 μm respectively in accordance with increasing passage. The inhibition of focal adhesion kinase prevented dedifferentiation of chondrocytes, and interestingly, the treated timing of focal adhesion kinase inhibitor seemed to be important for suppression of dedifferentiation. In chapter 2, we investigated the passage dependent chondrocytes responses to mechanical shear stress. We found that primary and dedifferentiated chondrocytes exhibit different responses under shear stress. The behavior of chondrocytes under shear stress showed passage-dependent migration and alignment during dedifferentiation. When the shear stress was applied to the dedifferentiated chondrocytes, the shear-induced chondrocytes in all passages, except P0 chondrocytes, showed a high rotation angle and a directedness value. The un-dedifferentiated chondrocytes (P0) had a low responsiveness to the shear stress and their alignment angles, and the travelling distance and directedness were slightly increased compared to the dedifferentiated cells. Also, the shear stress induced the difference of gene expression between the primary and dedifferentiated chondrocytes. The P0 chondrocytes barely responded to the shear stress while the P3 chondrocytes showed significant gene expression changes of dedifferentiation marker to the shear stress. The inhibition of focal adhesion kinase prevented the cell alignment and migration as well as the change of gene expression to the shear stress. This result suggested that focal adhesion kinase is the key mediator transmitted shear stress inside the cells and that activation of focal adhesion during dedifferentiation induced high responsiveness of chondrocytes to mechanical stresses. Our results imply that chondrocytes exhibit FAK-dependent susceptibility to mechanical impacts, and in healthy cartilage, they protect themselves to show reduced sensitivity to mechanical impacts. Also, dedifferentiated chondrocytes aggravate cartilage gets damaged under mechanical impacts due to high sensitivity. Furthermore, we suggest that restoration of chondrogenic property is important for preventing destructive effects on implantation of expanded chondrocytes.
연골조직은 지속적인 인체의 체중, 일상생활의 움직임 등을 통해 다양한 기계적 자극 (압축, 전단, 인장) 에 상시 노출되어 있다. 연골조직에 과도한 물리적 자극이 들어올 경우 연골 조직에 손상이 일어나게 되는데 연골 조직은 특이적으로 혈관과 림프관이 없는 조직으로써 그 재생이 혈관과 림프가 존재하는 골 근처의 연골 조직 쪽에서만 제한적으로만 이루어지게 된다. 연골세포의 항상성은 연골조직내의 유일한 세포인 연골세포에 의해서 조절되는데, 연골세포는 Type 2 collagen, Aggrecan 등의 연골 구성 물질을 분비해 연골 조직을 형성함과 동시에, MMP3, MMP9과 같은 단백질 분해 요소들을 분비함으로써 연골조직의 파괴를 유도함으로써 연골조직의 항상성을 유지할 수 있게 한다. 연골세포 역시 연골조직에 가해지는 것과 비슷한 다양한 물리적 자극을 지속적으로 받고 있으며 생체내의 다른 장기들에 비해 대단히 큰 압축, 인장, 전단응력을 받고 있다. 과도한 기계적 자극에 의해 연골 조직에 손상이 일어나는 경우 연골조직 주변부에서 국소적으로 탈분화 현상이 일어나게 되는데, 일반적으로 연골세포의 탈분화 현상은 연골세포의 체외 단층 배양시에 세포의 형태와 대사를 모두 변화시키는 연골세포 특이적인 현상이다. 탈분화 시에 연골 세포는 빠르게 자신의 특성을 잃고, 섬유아세포와 비슷한 형질로 변화되는 현상을 보이며, 세포 표현형에 큰 변화를 가져오는 것으로 알려져 있다. 다양한 물리적 자극에 대한 연골세포의 반응에 대한 기존 연구가 많이 존재하고 있으나 기존의 연구에서는 탈분화 된 세포에 과도한 물리적 자극이 일어날 경우에 어떠한 변화가 생기는지에 대해서는 아직 깊이 연구되지 않은 상황이다. 특히, 연골세포의 물리적 자극에 대한 반응에 대한 기존 연구는 대부분 체외 단층 배양 상태 즉, 탈분화가 진행된 상태에서 세포에 물리적 자극을 가했음에도 불구하고 이것이 연골세포의 고유특성으로 여기는 한계점이 존재한다. 일부의 연구에서는 추출 직후의 연골세포의 사용해서 물리적 자극을 가한 논문도 있으나, 이러한 연구 또한 정상 연골세포와 탈분화 된 연골세포간의 물리적 자극 특성이 다르다는 것을 인지하고 연구를 진행하지는 못했다. 본 연구는 기존 연구에서 미처 접근하지 못했던 연골세포의 탈분화에 따른 물리적 자극에 대한 반응성의 변화를 규명하고자 했다. 본 연구의 2장에서는 연골세포의 탈분화 현상에 대한 고찰과 그 억제 방법에 대해서 연구를 진행했다. 연골세포의 탈분화시 연골조직의 형성을 위해서 분비하는 collagen type II, aggrecan의 발현이 급격하게 줄어들고, 섬유아세포의 특징인 collagen type I의 발현이 급격하게 늘어나게 된다. 동시에 세포의 모양 크기도 큰 변화를 겪는데, 원래의 원형모양의 세포의 형태에서 길쭉한 형태로 변화하게 되며, 세포의 크기도 탈분화의 정도에 비례해서 증가하게 된다. 또한, 탈분화가 증가됨에 따라 크게 세포의 운동성 또한 크게 증대되는 것을 확인했다. 이러한 특성은 모두 세포 부착과 관련되는 특성들로써, 본 연구에서는 탈분화 과정 중에 세포 부탁과 관련된 어떠한 요소의 변화가 이러한 연골세포의 표현형의 변화를 유도하는 지 확인해보았다. 우리는 탈분화가 진행됨에 따라 세포와 ECM의 부착을 조절하는 focal adhesion complex, RhoA, Rac1의 발현이 크게 증가하게 된다는 것을 확인했고, 이를 탈분화를 통제하는 주요 메커니즘으로 선택했다. Focal adhesion 및 RhoA, Rac1의 억제제 실험을 통해서 우리는 focal adhesion의 억제가 연골세포의 탈분화를 억제 할 수 있다는 것을 확인했다. 또한 흥미롭게도 억제제의 처리 시점에 따라서 탈분화 억제 효과에 차이가 있음을 확인했는데, 이는 초기 세포 부착능의 조절이 연골세포의 탈분화 현상을 조절하는데 있어서 중요한 요소임을 확인했다.
본 연구의 3장에서는 탈분화 정도에 따라 전단 응력에 대한 반응성의 차이를 분석해 보았다. 우선 과도한 기계적 자극이 들어오는 상황을 가정했고, 이 상황에서 탈분화 정도에 따라서 세포 이동성, 세포 배열, 유전자 발현량에 어떤 차이를 보이는지 확인했다. 탈분화가 상대적으로 덜 일어난 연골 세포에서는 전단 응력에 대해서 거의 반응을 보이지 않았다. 그러나 탈분화가 상대적으로 충분히 일어난 연골 세포에 전단응력을 받았을 때는 세포가 전단 응력의 방향으로 배열이 되는 것을 확인할 수 있었고, 전단응력의 방향으로 이동성을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 통계적으로 유의미한 유전자 발현량의 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 탈분화의 정도에 따라서 기계적 자극에 대한 수용성에 차이가 생기는 것으로 볼 수 있으면 이에 연구 결과를 바탕으로 탈분화 과정 중에 증가했던 focal adhesion complex, RhoA, Rac1을 세포에 전단자극을 매개하는 요소로 선정했다. 우리는 이와 같은 세포의 재배열 및 이동성의 변화가 탈분화 과정중의 FAK의 발달에 의한 것인지 알아보기 위해 FAK 억제제를 처리해서 세포의 양상을 살펴봤다. 그 결과, FAK 억제제를 처리한 실험군의 경우 전단자극에 의한 세포의 이동이 크게 감소했고, 세포의 재배열도 억제되었고 이러한 결과는 전단자극이 FAK를 매개로 해서 세포로 전달된다는 것을 의미한다. 본 연구를 통해서, FAK가 연골세포의 탈분화에 깊숙이 관여하고 있고, 생체 내에서 실제 세포에 전달되고 있는 자극인 전단자극을 매개하고 있다는 것을 파악할 수 있었다.
Appendix에서는 탈분화 정도에 따른 연골세포의 인장자극에 대한 반응을 조사해 보았다. 현재까지의 결과로는 연골세포는 인장자극에 대해서도 탈분화에 따른 반응의 차이를 보이는 것으로 생각되며, 전단 자극과는 다르게 인장자극에서는 RhoA가 자극을 매개하는 인자로써 작용을 하는 것으로 생각된다. 추후 본 파트의 연구는 탈분화 정도에 따른 인장자극에 대한 연골세포의 반응 및 전단자극과 인장자극을 인지하는 매개인자의 차이에 대한 비교 분석 등을 좀 더 추가 연구를 진행하고자 한다.
