Endo-microscope is one of the promising tools to make a diagnosis without biopsy due to its high resolution imaging capability to visualize cellular features. Endoscopes like colonoscopes, gastroscopes, bronchoscopes and etc. were variously commercialized. And the tip of the endoscopes can be moved flexibly by some strips connected to the knobs located outside and navigate easily inside human organs with a large field of view (~100 mm). However, high resolution- and three dimensional-imaging is impossible with theses endoscopes. Endo-microscope is a compound word of ‘Endoscope’ and ‘Microscope’, which has high resolution imaging capability analogous to the optical microscope. Nowadays, confocal endo-microscope which can visualize three dimensional specimens is widespread. It can be inserted to the instrument channel having 2 mm~ 4.2 mm inner-diameter of the commercial endoscope. By navigating inside organ using the endoscopy, high resolution and three dimensional images at the specific site can be obtained using the confocal endo-microscope. However the confocal endo-microscope has a limitation that it can obtain only morphological images of samples.
In this dissertation, a multimodal endo-microscope which has an ability to obtain both morphological and functional images was proposed. To obtain functional images, an imaging mode of fluorescence lifetime imaging microscope (FLIM) was combined with a confocal imaging mode. Fluorescence lifetime is changed with quenching rate of the fluorescent matters. Because the quenching is differed by pH, concentrations of ions or oxygen and binding proteins of a biological specimen, measuring the fluorescence lifetime can make researchers to know the chemical circumstances of the sample. Especially, endogenous fluorophore, a reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), is a coenzyme concerned with celluar metabolism. Normal and abnormal (precancerous or cancerous) tissues can be easily differentiated by measuring the lifetime of these fluorophores contained naturally within the tissues.
To obtain high performance multimodal images, fiber-optic, raster scanning method was utilized. Several existing scanning methods have been mainly utilized spiral or lissajous pattern at a rate of a resonant frequency of the fiber cantilever. These methods have fixed scanning speed and lack of uniformity between the periphery and the center of the imaging field. Raster scanning method can be adopted relatively small range of an actuator combined with a lever amplification mechanism of an optical fiber. Non resonant and uniform scanning is possible with the scanning method. To maximize the scanning range, some simulations with a finite element method (FEM) tool were conducted at the various conditions. The length ratio of the lever was decided as 1.2 mm : 21 mm (1:17.5) with allowed materials. The outer diameter of the probe was 3.5 mm and its rigid distal length was 30 mm including a 7.5 mm rigid length, high numerical aperture gradient index (GRIN) lens.
The endogenous fluorophore existent in tissue is mostly excited with UV light (300 nm ~ 380 nm). Due to the fact that UV light is toxic to the living tissue, the light was replaced with a near infra-red laser with pulse width of femtosecond (~100 fs). By using two photon effect of the fluorophore, endogenous fluorophores can be excited without any harmful effects. However, while the femtosecond pulse is delivered through the fiber core, group velocity dispersion happens severely. Therefore, a customized prism pair produced with high refractive index- and high dispersion- material was used to pre-compensate the group velocity dispersion. The pulse width measured as 1710 fs without the prism pair was finally measured as 115.6 fs after the compensation.
Time-correlated single photon counting (TCSPC) method is a widespread lifetime measuring technique to overcome slow response of commercial detectors to measure fluorescence lifetime which is about few nanoseconds. The measurement of lifetime is conducted by calculating time difference between the detected signal from the detector and the reference sync signal directly inserted from the laser. About a hundred of detected points have to be accumulated to calculate one lifetime value each pixel position. The lifetime of the one pixel point can be calculated after curve fitting of the accumulated data. During the scanning of the fiber, the lifetime of the whole field can be calculated above methods. Using raster scanning method, the TCSPC method can be easily applied by input only three clock signals (pixel, line and frame clocks) using a commercial TCSPC board.
After multimodal endo-microscope was designed and developed, test images were obtained to evaluate its performance. The lateral- and axial-resolution were measured as 0.6733 μm and 3.095 μm respectively using minute fluorescent beads with a diameter of 170 nm. Instrument response function (IRF) measured as 164.44 ps and it was obtained by inserting the femtosecond laser to a detector directly. Finally, colon tissue images of human and mouse model (ApcMin) were obtained by using the developed endo-microscope system and compared pathological results to verify the possibilities to diagnose with the system.
내시현미경은 고분해능으로 조직의 형태를 측정할 수 있는 능력으로 인해 생검법을 대체할 수 있는 진단방법으로 촉망받고 있다. 대장내시경, 위내시경 같은 기존 상용 내시경들은 프로브 끝부분이 와이어 등의 구동부에 의해 자유롭게 움직일 수 있어 복잡한 장기 구조의 영상을 비교적 넓은 측정 범위(~100 mm)로 측정할 수 있다. 하지만 이러한 내시경은 고분해능 이미징, 삼차원 이미징이 불가능하다는 단점을 가지고 있다. 내시현미경이란, 내시경과 현미경의 복합어로써 광학 현미경 수준의 분해능을 가지는 내시경을 의미한다. 요즘에는 3차원 측정이 가능한 공초점 내시현미경이 개발되어 있으며, 상용 내시경에서 기구부를 삽입하는 2 mm ~ 4.2 mm 의 내경을 갖는 채널에 공초점 내시현미경의 삽입이 가능하다. 따라서 상용 내시경을 이용해 장기 내를 이동하는 도중에 공초점 내시현미경을 이용해 특정 부분의 고분해능, 삼차원 영상 획득이 가능하다. 하지만 이러한 공초점 내시현미경은 조직의 형태학적인 영상 정보만 얻을 수 있다는 단점을 가지고 있다.
본 논문에서는 형태학적 영상 정보뿐만 아니라 생화학적 영상 정보를 함께 얻을 수 있는 다중모드 내시현미경이 제안되었다. 생화학적 영상 정보를 얻기 위해서 형광 시상수 이미징 (FLIM) 기술이 공초점 이미징 기술과 결합되었다. 형광 시상수는 형광 물질의 소멸 속도 (quenching rate)에 따라 달라지는데 형광 신호의 소멸은 생체 조직의 페하(pH), 이온 농도, 산소 농도, 단백질 결합 여부에 따라 달라진다. 따라서 형광 시상수를 측정함으로써 조직 내의 생화학적인 정보를 알아낼 수 있다. 특히, 조직 내에 존재하는 자연물질인 NADH 는 형광 물질이며, 세포 대사에서 발생되는 부산물이다. 정상 조직과 비정상조직 (예. 전암 또는 암 조직)은 NADH의 형광 시상수를 측정함으로써 구분이 가능하다는 특징을 가지고 있다.
멀티모드 내시현미경을 구현하기 위하여 광섬유 래스터 스캐닝 방식이 사용되었다. 기존의 광섬유 스캐닝 방식은 주로 광섬유의 공진 주파수를 이용해 원형, 리사주 패턴의 스캐닝을 수행하였다. 하지만 기존 방법들은 스캐닝 속도가 고정되어 있고 스캐닝 영역의 외곽과 중심부분의 불균일한 스캐닝이 수행됨으로써 영상의 질이 떨어진다는 단점을 가지고 있다. 본 연구에서는 레버구조를 이용해 광섬유 구동 범위를 증폭함으로써 비교적 작은 구동 범위를 가지는 액츄에이터로 넓은 영역의 비공진 래스터 스캐닝을 구현하였다. 스캐닝 범위를 최대화 하기 위하여 유한요소 해석 툴을 이용해 다양한 조건에서 시뮬레이션이 수행되었고, 레버구조의 길이 비는 1:17.5로 결정되었다. 최종적으로 제작된 내시현미경 프로브의 직경은 3.5 mm, 길이는 7.5 mm의 고분해능 소형렌즈를 포함해 30 mm로 제작되었다.
생체 내에 존재하는 NADH 등의 자연형광 물질은 주로 300 nm ~ 380 nm의 자외선 영역에서 여기되지만, 자외선 영역은 조직에 유해한 것으로 알려져 있다. 따라서 사용되는 빛을 적외선 영역의 펄스레이저로 대체하고 이광자(two-photon) 효과를 이용해 유해한 영향 없이 자연형광 물질의 신호가 획득될 수 있도록 하였다. 하지만 펨토초 펄스 레이저는 광섬유 코어를 진행하면서 그룹속도 분산 (GVD) 현상이 일어나 이광자 효과의 효율이 급격히 떨어진다. 따라서 본 연구에서는 제작된 프리즘 한쌍을 이용해 그룹속도 분산 현상을 역으로 보상함으로써 효율을 높일 수 있었다. 기존의 82.8 fs 의 펄스폭을 가지는 레이저가 광섬유를 지나면서 1710 fs로 펄스폭이 증가되었으나 보상 후에는 115.6 fs까지 낮아지는 것을 측정할 수 있었다.
시간 상호 관련 단일 광자 계산 (TCSPC) 기술은 형광 시상수 측정을 위한 방법 중 하나이다. 시상수의 측정은 펄스 레이저로부터 들어오는 참조 신호와 검출기로부터 들어오는 신호의 시간차이를 측정하여 누적시키는 방법으로써, 적어도 백개 이상의 측정값들이 누적이 된 후 curve fitting을 통해 시상수를 측정하는 방법이다. 따라서 광섬유가 스캐닝 되는 동안 각각의 픽셀에서 측정데이터가 누적이 되며, 수초 ~ 수십초의 측정을 통해 전체 영역의 시상수가 정확히 얻어질 수 있다. 본 연구에서는 래스터 스캐닝 방식을 이용하여 상용 TCSPC 보드에 세 가지 클럭 신호(픽셀클럭, 라인클럭, 프레임클럭)만 입력함으로써 쉽게 시상수가 구해질 수 있도록 제작하였다.
다중모드 내시현미경의 설계와 제작이 진행된 후, 성능평가를 위하여 여러 테스트 영상이 획득되었고 횡방향, 종방향 분해능은 각각 0.6733 μm, 3.095 μm로 평가되었다. 형광 시상수 현미경의 성능지표인 장치 반응 함수(IRF)는 164.44 ps로 측정되었고, 이는 펨토초 레이저 신호를 그대로 검출기에 입사함으로써 얻어질 수 있었다. 제작된 다중모드 내시현미경을 이용하여 사람 대장 조직 및 질병 동물 조직의 영상을 획득하고 실제 병리학적 진단 결과와 비교함으로써 진단의 가능성을 확인하였다.
