Membrane bound $\gamma$-GTP was purified from bovine kidney. The first purification method includes bromelain solublization, acetone precipitation, salting out, DEAE-cellulose and Sephadex G-100 column chromatographies. The purification folds and yield were 44.3 and 11.9%, respectively. The second procedure includes microsome separation, Triton x-100 solublization, acetone treatment, gel filtration on Sephacryl S-300, and adsorption chromatography on hydroxyapetite column. The enzyme was purified by 393 folds and the yield was 18.6%.
The enzyme has a substrate specificity to $\gamma$-glutamyl peptides and S-blocked $\gamma$-glutamyl dipeptides were the best substrate among peptides tested. Dipeptides with glycine at its C-terminal end were better acceptors than other peptides. Among amino acids tested, methionine, cystein and glutamine can act as acceptors. Double reciprocal plots of the reaction velocities against varying the concentration of $\gamma$-glutamyl-p-nitroanilide at three fixed concentrations of glycylglycine showed parallel pattern.
In vitro and in vivo $\gamma$-GTP mediated amino acid transports were studied. Liposome incorporated with $\gamma$-GTP didn't transport methionine, alanine and leucine though methionine was a good acceptor among amino acids. In vivo experiments using unilaterial renal artery infusion also didn't show any evidences that this enzyme participates in the amino acid translocation. The unilateral injection of $\gamma$-GTP inhibitors (DON or Acivicine) or p-amino-hippurate induced a rise in pH of urine. The enzyme was activated by its own substrate in the absence of acceptor molecule but substrate activation disappeared in the presence of maleate or glyclyglycine. At high concentrations of glycylglcine, product inhibition pattern was observed only in the presence of maleic acid. The $\gamma$-GTP activity was inhibited competitively b maleate and the phenomena arised by maleate were arised not only by maleate but maleate analogues such as hippurate. This show a possibility that the hydrolysis and transfer activity can be regulated by physiological modulators. The two kinds of activities was also modulated by pH. That is, the hydrolytic activity was activated at pH 7.0 whereas it was suppressed at pH 8.0 in the presence of hippurate. This showed hydrolytic activity was the major one under physiological solution. In the presence of physiological modulators such as hippurate or maleate, glutamine can bind on the active site effectively. Therefore, glutaminase activity of $\gamma$ -GTP might be a major one under physiological conditions. This was testified partially and positive results were obtained. The possibility of the exposure of latent active site of the enzyme by physiological modulator was presented also.
소의 신장으로부터 $\gamma$-glutamyl transpeptidase를 정제하고 이들의 특이성을 연구하여 이 효소의 생리적 기능을 규명하고자 하였다. 먼저 이 효소의 정제는 두가지 방법을 이용하였는데 이 효소를 생체막으로 부터 유리하는데 있어서 먼저 효소를 bromelain을 이용하여 막으로부터 유리한 후 DEAE-cellulose chromatography와 Sephadex G-100을 이용한 gel filtration을 하였으며 그 결과 효소는 44.33배 정제되었고 그 수율은 11.9% 였다. 그리고 다른 방법으로는 Triton X-100을 이용한 효소의 유리로서 먼저 differential centrifugation을 이용하여 microsome 분획을 얻은 후 여기에 Triton X-100을 처리하여 효소를 막으로 부터 유리하였고 이어 aceton처리, Sephacryl S-300을 이용한 gel filtration과 hydroxyapatite column에서의 흡착 chromaptgraphy를 하였으며 최종적으로 효소는 393배 정제되었고 효소의 수율은 18.6%이었다.
효소의 기질 특이성을 보면 이 효소는 $\gamma$-glutamyl amino acide(dipeptide)에 작용은 하나 주로 $\gamma$-glutamyl dipeptide에 특이성을 보였으며 수용체에 대한 기질특이성을 보면 dipeptide에 특이성이 나타나며 특히 C-terminal 쪽이 glycine이나 alanine처럼 작은분자에 특이하게 작용하였다. 아미노산으로는 methionine, cystein, glutamine이 수용체로 작용할 수 있으나 그 정도는 dipeptide에 비해 상당히 낮았으며 특히 glutamine은 glycylglycine이 존재하는 경우에 낮은 농도에서는 효소의 활성을 약간 증가시키나 glycylglycine이 없는 경우에는 효소의 활성이 glutamine이 농도에 따라 증가하였다. 한편 $\gamma$-Glu-p-NA의 농도에 대한 반응속도를 double reciprocal plot 하였을 때 glycylglycine의 농도변화에 따라 parallel한 양상을 보여 주었다.
이 효소가 아미노산의 transport에 관여하는지를 밝히기 위하여 in vitro와 in vivo 실험을 수행하였는데 먼저 lecithin을 이용하여 liposome을 만든 후 liposome 내로의 아미노산 이동을 검정하였으나 methionine, alanine, leucine 등 어느 아미노산도 liposome내로 이동되지 않았으며 토끼의 신동맥에 $\gamma$-GTP의 저해제나 기질 등을 주입시켜본 결과 azaserine은 신장에서 여과되지 않음이 확인되었고 DON, acivicin은 신장에서 여과되나 methionine의 재흡수를 촉진시키는 것이 아니라 오히려 감소시켰으며 이들의 처리에 의해 요의 pH가 변하는 것이 확인되었다.
이 효소는 수용체가 존재하지 않는 경우 기질의 농도에 의해 포화되지 않으며 오히려 활성화되는 경향이 나타나는데 이러한 현상은 maleate나 glycylglycine의 첨가에 의해 사라졌으며 이 밖에도 maleate는 glycylglycine이 존재할 경우에는 효소의 활성을 감소시키고 존재하지 않은 경우에는 효소의 활성을 증가시켰으며 ammnonium hydroxide 존재하에 $\gamma$-glutamyl hydorxamate의 형성을 증가시켰으며 glycylglycine의 존재하에 $\gamma$-glu-p-NA의 농도에 대해 경쟁적으로 저해를 나타내었다. Maleate가 효소의 활성에 미치는 영향을 종합해 볼 때 이 효소의 활성부위는 두개가 있어 이들에 의해 hydrolysis와 transfer가 조절될 수 있다는 가능성을 볼수 있었고 따라서 maleate는 $\gamma$-GTP의 modulator로 작용한다고 볼 수 있다. 이러 한 조절은 maleate 뿐 아니라 이와 유사한 hippurate나 phthalate 등에 의해서도 나타났으며 pH에 따라서도 효소의 활성이 조절됨이 밝혀졌다. 이에 생리적 조건하에서 이 효소는 생리 조절물질의 양과 pH의 변화에 의해 조절되며 특히 생리조절물질이 효소에 결합하는 경우 glutamine의 결합을 촉진하여 glutaminase의 활성화를 유도하며 이러한 변화는 latent active site의 노출에 의한것으로 판단되었다.
