To understand the structure and physiological function of the hnRNA, cDNA clones for the most typical and abundant hnRNA have been isolated.
Pure form of hnRNA was isolate from ribosomal RNA and tRNA by immunoaffinity chromatography with the monoclonal antibody (4F4) to the hnRNP proteins. First strand cDNA was synthesized using random hexamer as a primer and a cDNA library was constructed in λgt11 vector. Recombinant phage clones of the hnRNA were isolated from the cDNA library by plaque hybridization with $^{32}P$ labeled first strand cDNA of the hnRNA as a probe. Strongly positive plaques were labeled as S series and weakly positive plaques were labeled as W series. It was assumed that the signal intensity and the frequency of the positive plaques were propotional to the abundance of the specific hnRNA.
Most of nucleus confined hnRNA contains Alu repeated sequence on the basis of the Southern blot hybridization and nucleotide sequence analysis. Comparison of the Alu related sequences, the base substitutions of Alu repeated sequences are fairly random. However, 17 bp direct repeats (TTGCAGTGAGCCAAGAT) are well conserved. Another direct repeats was also present in their franking regions. It suggest that Alu repeated sequence are the result of insertion mechanism.
The cDNA clone, W16W, hybridized to the discrete hnRNA transcripts in non-polyadenylated nuclear RNA fraction, but barely to the polyadenylated nuclear RNA and cytoplasmic mRNA, if any. It suggest that the transcripts corresponding to W16W are confined in the nucleus and not polyadenylated in its 3'-termini. It also suggest the expression of the transcript could be controlled at post transcriptional or transport level rather than at transcriptional or translational level. The size of corresponding hnRNAs are estimated to be about 1.2-1.3 kb. The transcription of the transcript was senstive to Actinomycin D treatment arguing for RNA polymerse II transcript. The transcript of W16W however remains relatively stable when the hnRNA transcription was inhibited b 5 μg/ml of Actinomycin D. The precursor to the actin mRNA was not detected under those condition. The results demonstrate that the presence of relatively abundant and stable non-polyadenylated hnRNA with discrete size. The transcript was not found in other vertebrate tested exept HeLa cell. Genomic Southrn blot analysis suggest that the transcript was transcribed from a single copy gene. The largest open reading frame possible was 240 bp in length, and the sequence did not match to the sequence entry in Gene Bank (EMBL Data Library).
Physiological function and molecular signal of transport of these W16W transcript remains to be studied.
Pre-mRNA와 핵에 한정된 hnRNA의 processing 및 transport signal을 규명하고 동시에 핵 안에서 일어나는 pre-mRNA 대사에 관한 hnRNA의 기능을 연구하기 위하여 hnRNA의 cDNA clone을 분리 하였다. HnRNP 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 침전법에 의해 순수한 hnRNA를 분리 하였다. 특히 순수한 hnRNA 중에서 3'poly(A) tail을 가지고 있지않은 non-plyadenylated hnRNA에 대한 cDNA를 random primer 와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 합성하였다. 이 때 hnRNA의 대부분은 공통 sequence가 없을 뿐더러 3'-poly(A) tail도 갖고 있지 않으므로, random hexamer를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 hnRNA의 cDNA library를 제조하였다. 방사능으로 표지한 hnRNA cDNA를 probe로 사용하여 hnRNA 중에서 가장 양이 많고 형태가 분명한 것의 cDNA clone을 분리 하고 2차 3차 선별을 통해 신호의 재현성이 있는 것으로 최종 분리 하였다.
대부분의 clone은 Southern blotting에 의해 사람의 Alu repeated sequence와 매우 유사한 전사체들이었고, dideoxy 법에 의해 염기 서열을 결정해 본 결과 S7S, S11S, S3S 등은 Alu consensus sequence에 비해 몇몇 염기들이 규칙 없이 치환된 형태의 clone 들이었고 S14S는 그 유사성이 낮으면서 길이와 염기 서열 면에서 많은 차이가 있는 것으로 판명 되었다. 그러나 이들 clone 모두는 TTGCA GTGAG CCAAG AT의 17 bp 의 direct repeats이 특징적으로 존재하고 있었다. 이것은 Alu repeated sequence가 단일 유전자로 부터 진화해 왔을 가능성을 시사해 주고 있다. 특히 이들은 Alu sequence 영역 바같 쪽에 또 다른 direct repeats이 존재하고 있었는데 이것은 Alu repeated sequence가 삽입 기작에의해 적절한 장소에 끼어들었을 가능성을 시사해 주고 있다.
Alu sequence와 유사성을 갖고 있지 않은 W16W clone은 Northern blot 분석 결과 크기가 분명한 약 1.2-1.6 kb의 다수의 전사체를 가지고 있었으며, actin의 premRNA가 탐지되지 않는 조건에서 강하게 탐지가 되는 것으로 보아 그 전사체의 수도 많은 것으로 판명되었다. 이 전사체의 특징은 핵 안에서만 한정 되어 있으며 3' poly (A) tail도 가지고 있지 않은 것으로 나타났다. 이것은 이 전사체가 발현 되기 위해서는 전사나 번역 단계의 조절 보다는 전사 후 혹은 세포질 전달 과정에서 조절될 가능성이 있음을 시사해 주고 있다. 특히 이 전사체는 5 μg/ml의 Actinomycin D에 의해서도 비교적 안정한 형태로 존재하는 것으로 보아 매우 안정하여 그 반감기도 큰 것으로 보아진다. 또한 이 전사체가 HeLa S3 세포 이외의 3T3, CV-1에는 존재하지 않은 것으로 보아 HeLa 세포에 특이적인 전사체로 판명 되었다. genomic Southern blot 분석 결과 이 전사체는 haploid genome 상에서 단일 copy 유전자로 부터 유래된 것임을 확인 할 수 있었고 그 염기 서열은 현재까지 보고되어 Gene Bank 안에 저장된 서열과는 일치하지 않는 새로운 염기 서열을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다.
