Ampicillin acylase, which is known to have a novel substrate spectrum, was purified to homogeneity from Pseudomonas melanogenum by the crude extract preparation and chromatography with S-Sepharose, hydroxyapatite, CM-cellulose C-52, and CM-Sepharose. The enzyme was purified 8847-fold from the crude extract, with a final recovery of 12%. The molecular weight of the native enzyme was calculated to be 146,000 by Protein PAK-300 sw HPLC chromatography. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the enzyme consisted of two identical subunits with a molecular weight of 72.000. The enzyme was a glycoprotein containing 13% total carbohydrate, and its isoelectric point was 7.2. The optimal temperature for enzymatic activity was found to be 37°C with a pH optimum of 6.0.
The enzyme catalyzed both synthesis and hydrolysis of ampicillin and hydrolysis of the ester bond of phenylglycinemethylester hydrochloride substrate. The substrate specificity showed that the enzyme required a free amino group on the α-carbon of the acyl group.
The chemical modification of purified ampicillin acylase by N-bromosuccinimide and diethlpyrocarbonate resulted in time-dependent inactivation of the enzyme. Both substrates ampicillin and 6-aminopenicillanic acid protected the enzyme against inactivation, suggesting that the modification occurred near or at the active site. Amino acid analyses and other data indicated that two histidyl residues per subunit molecule were essential for catalytic activity.
효소를 사용한 베타락탐계 항생제의 반합성에 대한 연구의 결과 이러한 반합성 활성을 보이는 많은 종류의 페니실린 아실라제가 발견되었다. 그 중 Pseudomonas melanogenum 에 존재하는 앰피실린 아실라제는 α-카본 위치에 free amine group이 있는 기질에 대해서만 반합성 활성을 보이는 흥미로운 효소로 알려져왔다. 본 연구에서는 이 미생물로부터 앰피실린 아실라제를 분리 정제하여 그의 효소학적 특성을 규명하고, 반합성 활성을 나타내는 활성부위의 구조에 대한 연구가 조사되었다.
Pseudomonas melanogenum 의 세포내부에 있는 앰피실린 아실라제는 S-Sepharose Hydroxyapatite, CM-Cellulose C-52, CM-Sepharose 4단계의 크로마토 그래피를 통해 약 12% 수율로 분리 정제되어 단백질 전기영동, 분석 등전점 초점화에 의해 단일 밴드로 정제가 되었음을 확인하였다. 이 효소는 2개의 동일한 subunit 를 가지는 분자량 약 146,000 의 단백질로서 13%의 탄수화물을 함유하고 있었고 등전점은 7.2 이었다. 아미노산의 함량 분석후 α-amino acid ester hydrolase 비교하여 본 결과 그들의 아미노산 함량비율이 대단히 유사한것으로 판명되었다. 이들의 최적 반응 온도와 최적 pH 는 표준 반응 조건하에서 37°C와 6.0 이었다.
순수 정제된 효소를 사용하여 기질에 대한 특이성을 조사한 결과, 기질의 Acyl group 의 α-카본 부위에 free amine group 이 반드시 필요함을 확인하였다. 이 효소의 대표적 기질중의 하나인 앰피실린에 대한 작용모드가 HPLC 에 의해 조사되었으며 그 결과 앰피실린의 합성과 분해 Acyl donor 의 비가역적 분해등 세가지 반응이 일어남을 확인하였다.
효소의 독특한 기질 특이성을 나타내는 활성 부위에 대한 연구로서 효소의 촉매 활성에 요구되는 필수 아미노산이 화학적 수식에 의해 조사되었다. 이 효소는 N-bromosuccinimide 와 diethylpyrocarbonate 에 의해 시간에 따라서 효소활성이 저해가 되었으며, 또한 N-bromosuccinimde 의 효소 활성 저해에 대해 이 효소의 기질인 6-Amino penicillanic acid 와 앰피실린이 기질 보호 효과를 보임으로서, 여러가지 효소 저해제와 필수 아미노산의 반응 선택성의 관계를 고려할때 histidine 이 효소 활성 부위에 관여하는것으로 생각되었다. N-bromosuccinimide 에 의해 화학적 수식이 된 앰피실린 아실라제의 아미노산 함량분석의 결과, 효소의 subunit 당 변화 된 histidine 의 수와 효소의 잔류 활성과 일정한 관계가 있음이 밝혀져, 그 결과 이 효소의 촉매 활성에 subunit 당 2개의 histidine 이 필수적 아미노산인것으로 나타났다.
