In this thesis, the content will be classified into two main parts; [1] Studies on the early step of bacteriophage N4 infection, [2] Purification and characterization of Stu I endonuclease.
For the first part, the novel genes from bacterial strains Proteus vulgaris and Brevibacterium albidum, which render the host resistant to both phages of N4 and a λlib, a randomly selected λ derivative from the human genomic library, has been analyzed. The following experimental results obtained from the study of the genes supported the possibility that phage N4 shares some components of host cells with λ in the early step of its infection processes. (i) The clones transformed by one of the recombinant plasmids, pRMG101 (contains the genes from P. vulgaris) or pRMG216 (contains the genes from B. albidum), were resistant to both λlib and N4, but sensitive to Φ80vir, T4, and T7. (ii) Naked phage DNAs of λlib and N4 were transfected and propagated successfully even when the host cell carried one of the two plasmid DNAs (pRMG101AB and pRMG216). (iii) When pBR322 DNA was used instead of pUC9 DNA to carry the genes from Proteus vulgaris, the degree of resistance of the E. coli host having this plasmid was reduced both in N4 and λ phages. It seems to be due to the smaller copy number of pBR322 than that of pUC9. (iv) E. coli K-12/pRMG101AB and E. coli K12/pRMG216 lost their resistance to N4 and λlib simultaneously when they experienced some physiological changes by grown in maltose medium. On the basis of above implications, the interrelationship between N4 and the host components mediating λ infection in the early step was investigated. N4 phage grows normally on the various lamB mutants of E. coli, which are resistant to λ because of the abnormality or the absence of LamB protein, the receptor molecule for λ. This result indicates that LamB is not the only required component for N4 to adsorb onto the host cell surface. However, N4 phage cannot grow on the mutant strains of E. coli, WA3155 and WA2127, which are deficient of one or all of the three subunits of mannose permease and cannot mediate the penetration of λ DNA. Complementation experiments by using three recombinant plasmids, pTSPM8, pTSP11, and pTSM4 which contain DNA fragment coding for one or all of the two subunits of mannose permease, II-$P^{Man}$ and II-$M^{Man}$, revealed that among the three components, II-$P^{Man}$ and II-$M^{Man}$ alone are sufficient to confer N4 sensitivity as is the case of λ phage. However, it is unlikely that there is any specific interaction between mannose permease and the protein product of the phage resistant genes on pRMG101AB. The reason is that E. coli WDT87/pRMG101AB is fully sensitive to the virulent mutant of λ phage and that pRMG101AB also inhibits the infection of the host cell by Φ80vir phage 50 times compared with pUC9.
For the second part, Stu I, a Type II restriction endonuclease, has been purified to homogeniety from Streptomyces tubercidicus (ATCC 25502), and its catalytic properties have been studied. For the purification of Stu I endonuclease, DEAE-Sephadex (A-50), GAE-Sephadex (A-50), and Heparin-agarose column chrpmatography have been performed after ammonium sulfate fractionation of the crude extract. The enzyme was further purified by gel filtration using Sephadex G-100 column to obtain homogeneous form of the protein. The purified Stu I endonuclease has a single polypeptide species and its subunit molecular weight was 34,000 ± 1,000 daltons as judged by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. Stu I endonuclease requird $Mg^{2+}$ ion for its activity and was maximally active at neutral pH (7.0 - 8.0) in the absence of NaCl.
이 논문에는 두 가지의 연구 내용이 포함되었다. 첫째는 박테리오 파아지 N4 감염 초기단계에 대한 연구이고, 두번째가 Type II 제한효소 Stu I 의 분리 정제와 효소적 특성에 대한 연구이다.
첫번째 연구로서, 숙주세포로 하여금 유독 박테리오 파아지 N4 및 λlib (human genomic library 에서 선택한 lambda 의 일종)에 강한 내성을 갖게하는 재조합 플라스미드 상의 유전자를 분석하여, 숙주세포의 어떤 한 구성요소가 N4 및 lambda 의 감염 초기 단계를 모두 중개할 것이라는 가능성을 뒷받침하는 다음과 같은 실험 결과들을 얻었다. 첫째, 재조합 플라스미드 pRMG101AB 또는 pRMG216 을 보유하는 숙주세포는 유독 N4 및 λlib 에는 강한 내성을 보이고, Φ80vir, T4, T7 파아지들에는 잘 감염되었다. 둘째, 숙주세포가 pRMG101AB 또는 pRMG216 을 보유하였을지라도, 그 숙주세포에 N4, λlib 의 정제된 DNA 를 형질도입시켰을 때, 두 파아지가 모두 숙주세포 안에서 잘 성장하여 새로운 파아지를 산출하였다. 셋째, pRMG101 상의 Proteus vulgaris 로부터 유래한 유전자는 pUC9 벡터에 있을 때에 비해 pBR322 벡터에 있음으로 해서 숙주세포 의 N4 및 λlib 에 대한 내성이 모두 감소되었다. 이는 숙주세포 내에서의 각 플래스미드의 copy number 차이때문일 것으로 생각된다. 넷째, E. coli K-12/pRMG101AB 와 E. coli K-12/pRMG216 을, maltose를 유일한 탄소원으로 공급한 배지에서 키웠을 때, N4 및 λlib 에 대한 내성을 모두 상실하였다. 이상의 결과들을 바탕으로, lambda 파아지가 숙주세포에 흡착하는데에 필요한 LamB 단백질, 또는 lambda DNA 의 유입을 중개하는 mannose permease 가 N4 파아지의 감염도 중개하는지를, LamB 또는 mannose permease 가 변형되거나 상실된 돌연변이주들을 사용하여 검토하였다. N4 파아지는 LamB 단백질이 변형되거나 상실된 대장균의 돌연변이주들 모두에서 잘 성장하였으나, mannose permease 의 subunit 들 중 하나 또는 전부가 결핍되어 있는 대장균의 돌연변이주 WA3155 와 WA2127 에서는 성장하지 못하였다. 따라서 LamB 단백질은 N4 파아지의 감염에 필요치 않으나, mannose permease 는 N4의 감염을 중개함을 알 수 있었다. mannose permease의 두 subunit, II-$P^{Man}$ 와 II-$M^{Man}$ 을 coding 하는 ptsP 와 ptsM 유전자의 전부 혹은 하나 만을 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하여, 두 변이주 WA3155 와 WA2127 을 complementation 해본 결과, lambda 의 경우와 마찬가지로, mannose permease 의 세 subunit들 중 II-$P^{Man}$ 와 II-$M^{Man}$ 만으로 N4 의 감염이 중개된다는 것을 확인하였다. 하지만 pRMG101AB 상의, 파아지에 대한 내성을 부여하는 유전자로부터 만들어지는 단백질과 mannose permease 와는 어떤 독특한 상호작용이 있는것 같지는 않은데, 그 이유는 pRMG101AB를 보유하는 E. coli 균주에 virulent mutant 인 lambda 가 잘 감염하였고, 또한 이 균주에서는 Φ80vir 의 감염도 pUC9 플래스미드를 갖는 균주에 비해 50배 정도 저해되는 것이 관찰되었기 때문이다.
Type II 제한효소 Stu I을 정제하고 그 효소적 특성을 연구하였다. 100 g (wet weight) 의 Strepomyces tubercidicus (ATCC25502)로부터 얻은 crude extract를 ammonium sulfate fractionation 한 후, DEAE-Sephadex (A-50) QAE-Sephadex (A-50) 그리고 Heparin-agarose 의 순서로 column chromatography를 수행하여 1.2 mg의 비특이성 nuclease가 없는 Stu I 제한효소를 얻었다. 이 시료에 포함되어 있는 다른 오염 단백질은 Sephadex G-100 column 으로 gel filtration 하여 제거함으로써, 순수한 Stu I 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 Stu I 제한효소는 10 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 결과, 한 개의 band 로 나타났으며, 그 분자량은 34,000 ± 1,000 dalton 이었다. 이 효소는 $Mg^{2+}$ 이온 존재 하에 중성의 pH (7.0 - 8.0) 에서 최대의 활성을 나타내었다. NaCl 은 이 효소의 활성에는 필요하지 않았다.
