Hemocyanin of Portunus trituberculatus was purified. SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were performed to investigate size homogeneity of hemocyanin. The electrophoretic pattern of purified hemocyanin with detergent, SDS in 7.5% gel revealed a single band with a molecular weight of about 75,000 indicating a size homogeneity of the Portunus trituberculatus hemocyanin subunit. The purified hemocyanin was then subjected to alkaline electrophoresis without detergent. DAVIS-PAGE of hemocyanin in pH 7.5 showed polymorphism of monomers, hexamers, and higher polymers.
In order to determine the charge heterogeneity of monomeric subunits, DAVIS-PAGE were performed. While SDS-PAGE showed no size heterogeneity of the monomeric subunit of Portunus trituberculatus, DAVIS-PAGE in high acrylamide concentration showed at least four monomeric subunits. In order to confirm the charge heterogeneity of Portunus trituberculatus hemocyanin, continuous polyacrylamide gel electrophoresis was performed. While nondissociating buffer (Tris/HCl-$CaCl_2$ buffer pH 7.5) demonstrated only polymeric forms without monomeric fractions, continuous-PAGE in a dissociating buffer (Tris/HCl-EDTA buffer pH 8.9) showed that monomeric subunits of Portunus trituberculatus hemocyanin were resolved into four distinct bands, designated as I, II, III, and IV. This agreed with the results of DAVIS-PAGE in 7.5% gel. From these result, we adapted continuous-PAGE in a nondissociating buffer to observe and isolate the polymeric forms of hemocyanin, and in a dissociating buffer to obtain the monomeric subunits of hemocyanin.
To investigate the antigenic heterogeneity of hemocyanin subunits, the experiments of immunoelectrophoresis using anti-whole Portunus trituberculatus hemocyanin antiserum were carried out. The crossed immunoelectrophoresis (CIE) of whole hemocyanin revealed four distinct peaks, as four monomeric bands were observed in continuous-PAGE. These four peaks did not show any partial identity with each other, which suggested the occurrence of at least four kinds of antigenically distinct subunits in Portunus trituberculatus hemocyanin.
Each monomeric subunit revealed by continuous-PAGE in the dissociating buffer was then isolated from the gel. The isolated monomeric subunits were all subjected to CIE. The results of the CIE of each monomeric subunit, isolated from continuous-PAGE, indicated antigenical purity of all subunits. From the experiments of tandem CIE, all four monomeric subunits, isolated from continuous-PAGE, could be identified among the four peaks revealed in the CIE of whole hemocyanin.
The polymeric forms of Portunus tribuberculatus hemocyanin were also isolated by continuous-PAGE. The isolated polymers were then analysed by CIE and tandem CIE to investigate the composition of subunits. The CIE of hexamers revealed three precipitation peaks, whereas the CIE of dodecamers revealed four precipitation peaks as observed in whole hemocyanin. These results allowed us to conclude to the absence of one subunits in the hexamers and to its presence in dodecamers. The absence of subunit IV in hexamers was elucidated by the experiments of tandem CIE of hexamers with the subunit III and IV in the reference well. On the other hand, reconstitution of polymeric forms from isolated monomeric subunits was investigated. The reconstitution processes with monomeric subunit I, II, and III, resulted in almost complete conversion to the hexamers. Hexamers, however, are not formed from subunit IV alone. These results also supported the observation of the absence of subunit IV in hexamers. The hexamers were the largest aggregates produced when only the monomeric subunit was present ; i.e., no dodecamers were formed from any subunit. In spite of the fact that hexamers should be a major constituent of dodecamers, the reconstitution of dodecamers was not a simple dimerization of hexamers.
Hybridomas against Portunus trituberculatus hemocyanin have been prepared by fusing mouse myeloma (Sp2/0-Ag14) cells with spleen cells of mice immunized with hemocyanin. Six monoclonal antibodies, referred to as MAB2, MAB5, MAB6, MAB9, MAB12, and MAB14, were cloned, and ascitic fluids against MAB5 and MAB6 were collected. The MABs obtained showed an inhibiting effect on pseudoperoxidase activity of Portunus trituberculatus hemocyanin. The heavy chain isotype of MABs was determined by double immunodiffusion against antisera of six mouse immunolobulin isotypes (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, and IgM). All six MABs showed precipitation line against anti-mouse IgG1.
Immunological cross-reactivities between three species (Portunus trituberculatus; Pt, Eriocheir sinensis; Es, Megathura crenulata; Kl) were studied to investigate the common antigenic determinants. A rabbit antiserum to Pt hemocyanin cross-reacted in agar with Es hemocyanin, showing a double precipitation line, but no cross-reaction with Kl hemocyanin was observed. Similarly, the antiserum to Es hemocyanin cross-reacted with Pt hemocyanin, but not with Kl hemocyanin. Therefore, the common antigenic determinants between Pt and Es hemocyanin was present, but Kl hemocyanin did not show any common antigenic determinants with the other two species.
본 연구에서는 꽃게 헤모시아닌의 생화학적 특성에 관하여 면역학적인 방법을 이용하여 연구하였다. 꽃게 헤모시아닌은 SDS를 포합한 전기영동에서 75,000정도의 분자량을 갖는 단일 밴드를 나타냈다. 따라서 꽃게 헤모시아닌 구성체는 분자량 크기에 따른 이질성은 보이지 않았다. DAVIS 방법에 의한 전기영동 결과 pH 7.5에서는 monomer, hexamer (6-mer), dodecamer (12-mer), 및 그 이상의 크기를 갖는 polymer를 나타내어 다양성을 보였다. 반면에 1 mM EDTA를 첨가한 DAVIS-PAGE에서는 monomer로 보이는 이중 밴드를 나타내었다. 또한 acrylamide 농도 7.5% 에서 실시한 DAVIS-PAGE결과 꽃게 헤모시아닌의 monomer는 네 개의 밴드로 나타났다. SDS-PAGE에서 분자량 차이에 의한 monomer의 이질성은 보이지 않았지만 DAVIS-PAGE에서는 꽃게 헤모시아닌의 monomer가 최소한 네 종류인 것이 밝혀졌다. 이러한 사실은 continuous-PAGE에서 확실히 나타났다. dissociating buffer에서 실시한 continuous-PAGE에서도 네개의 monomer 밴드가 나타났는데 이를 각각 subunit I, II, III, IV라 명명하였다.
한편 면역학적 방법은 헤모시아닌 구성체의 antigenic heterogeneity를 연구하는데 매우 유용하게 사용되고 있다. 본 연구에서는 꽃게 헤모시아닌에 대한 항체를 이용하여 꽃게 헤모시아닌의 subunit heterogeneity를 연구하였다. 꽃게 헤모시아닌에 대한 이차원 면역전기영동 (crossed immunoelectrophoresis, CIE) 결과 continuous-PAGE 에서와 같이 네개의 뚜렷한 피크를 나타내었다. 이들은 면역학적으로 서로 독립적이었다. continuous-PAGE 에서 나타난 I, II, III, IV, 네개의 monomer를 분리하여 각각에 대해서 이차원 면역전기영동을 실시한 결과 모두 면역학적으로 순수하였다. 또한 continuous-PAGE 에서 나타난 꽃게 헤모시아닌의 네개의 monomer 밴드와 이차원 면역전기영동에서 나타난 네개의 피크를 비교하기위해서 위에서 분리한 네개의 monomer와 전체 꽃게 헤모시아닌에 대해서 tandem CIE를 실시하였다. 그 결과 continuous-PAGE 에서 나타난 네개의 band는 각각 이차원 면역전기영동상의 피크와 일치하였다.
꽃게 헤모시아닌에는 hexamer와 dodecamer가 중요 polymer로 monomer와 함께 존재하고, monomer는 네개의 서로 다른 것이 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 hexamer 와 dodecamer의 subunit composition을 연구하였다. 꽃게 헤모시아닌의 hexamer와 dodecamer를 nondissociating buffer에서 실시한 continuous-PAGE 로 부터 분리하였다. 분리된 polymer에 대한 CIE와 tandem CIE 결과는 다음과 같다. Hexamer 에 대한 이차원 면역전기영동 결과는 세개의 피크를 보인 반면에 dodecamer는 전체 헤모시아닌과 같이 네개의 피크를 나타내었다. 이것은 hexamer에는 네개의 monomer중 하나가 없다는 것을 나타낸 것이다. 어떤 monomer가 없는가를 밝히기 위해서 Tandem CIE를 실시한 결과 꽃게 헤모시아닌의 hexamer에는 subunit IV 가 없는 것으로 나타났다. 한편 분리한 subunit으로 부터 polymer의 재구성 실험을 한 결과 subunit I, II, III 는 hexamer를 형성하는 반면에 subunit IV는 hexamer를 형성하지 않았다. 이상의 결과는 subunit IV가 dodecamer 형성에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 것을 제시해준다. 그러나 dodecamer는 hexamer와 subunit IV를 혼합해도 전기영동상에서는 재구성되지 않았다.
꽃게 헤모시아닌에 대한 단일항체를 만들어서 여섯 종류의 hybridoma를 cloning하였다. 이들은 모두 heavy chain이 IgGl 이었으며 헤모시아닌의 pseudoperoxidase activity를 저해하였다.
서로 다른 종의 헤모시아닌 사이의 similarity를 조사하기 위하여 세개의 종 (Portunus trituberculatus, Eriocheir sinensis, Megathura crenulata)을 선택하여 헤모시아닌에 대한 항체를 이용한 면역학적인 상호작용을 조사하였다. 꽃게 헤모시아닌에 대한 항체는 Eriocheir sinensis 헤모시아닌과 cross-reactivity를 나타낸 반면에 Megathura crenulata 헤모시아닌과는 cross-reactivity 를 보이지 않았다. 또한 Eriocheir sinensis 헤모시아닌에 대한 항체도 꽃게 헤모시아닌과 cross-reactivity 를 나타내었지만 Megathura crenulata 헤모시아닌과는 꽃게 헤모시아닌과 마찬가지로 cross-reactivity가 없었다. 따라서 꽃게 헤모시아닌과 Eriocheir sinensis 헤모시아닌 사이에는 common antigenic determinants가 존재하는 것으로 보인다.
