Two β-glucosidase genes of $\underline{Cellulomonas fimi}$ ATCC484 were cloned in $\underline{ Escherichia coli}$ JM83 using plasmid pUC9 as a vector. The gene contained in a constructed plasmid pCF85 encoded enzyme which hydrolyzed both p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside (PNPG) and cellobiose, while the gene contained in pCF115 produced enzyme which hydrolyzed only PNPG. Southern hybridization indicates that the genes contained in the two plasmids, pCF85 and pCF115, are not identical. Since the enzyme activity originated by the two genes depended on the orientation of the chromosomal inserts in the vector plasmid, the genes seem to be under the control of the lacZ promoter of pUC9 in $\underline{E. coli}$. Since I have been interested in an enzyme which hydrolyze cellobiose, my further study was concentrated on the gene contained in pCF85. The size of the C. fimi chromosomal insert in the recombinant plasmid pCF85 was found to have a strong effect on the production of β-glucosidase. Through a sequential subclonings, the size of the chromosomal insert was reduced to 1.8 kb and constructed a new plasmid pCF18. The enzyme encoded by the gene in pCF18 cleaved cellobiose into two molecules of glucose, and thus, the gene cloned in pCF18 was identified as a true β-glucosidase gene.
The enzyme from crude extract of $\underline{E. coli}$ (pCF18) was purified. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of these final preparations revealed that molecular weight of this enzyme was 56,000 dalton. And analytical gel filtration suggested that this enzyme consists of a single polypeptide.
Inhibition caused by heavy metals and activation by dithiothreitol suggest the existence of essential thiol group in the enzyme. The fact that an enzyme solution containing dithiothreitol showed increase in heat stability also suggests the importance of -SH group in this enzyme. The enzyme was not active on maltose (glucose α-1,4-glucose) which have α-linkage, whereas it was active on lactose (galactose β-1,4-glucose), cellobiose (glucose β-1,4-glucose), PNPG (p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside) and PNPC (p-nitrophenyl β-D-cellobioside), although its reaction rates were different.
A complete nucleotide sequence of the β-glucosidase gene was determined. The β-glucosidase gene consists of an open reading frame, 1,452 bp long, commencing ATG start codon encoding a polypeptide of 482 amino acid residues and TGA stop codon.
The predicted amino acid sequence of the $\underline{Cellulomonas fimi}$ β-glucosidase gene showed approximately 37% of homology with that of $\underline{Agrobacterium}$ sp. especially, in N-terminal (51.0% homology) and in C-terminal (45.4% homology) at protein level. If conservative substitutions are allowed, the degree of homology increases to more than 84% in N-terminal and 76% in C-terminal, respectively.
Codon usage was not random and appears more closely related to the frequencies reported in other $\underline{Cellulomonas fimi}$ cellulase genes. There is a 86.6% bias towards the use of G or C in the third position of those codons used in the β-blucosidase for the -glucosidase gene were 54.9 and 72.3%. The overall G+C content of the genus $\underline{Cellulomonas}$ reported in Bergy's Manual of Systematic Bacteriology is 71.3 to 72.0%, and the G+C content of the -glucosidase gene is 71.2%.
A putative ribosome binding site was founded in the upstream of the translation initiation codon of β-glucosidase gene. And possible "-35" and "-10" promoter region which was strongly homologous to the consensus sequence suggested in other Cellulomonas fimi cellulase genes. The nucleotide sequence following TGA stop codon was shown to include a sequence containing four inverted repeats which could form stem-loop structures.
섬유소의 효소적 분해과정에서 마지막 단계인 cellobiose 를 포도당으로 전환시키는 효소인 β-glucosidase 의 유전자를 $\underline{Cellulomonas fimi}$ ATCC 484 로 부터 분리 하였다. 이때 숙주로는 대장균을, 유전자 운반체로는 pUC9 plasmid 를 사용하였고, β-glucosidase 유전자를 갖고 있는 대장균을 찾아내기 위하여 기질로 p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside 를 이용 하였다. 그 결과 형질전환된 대장균들 로 부터 2개의 유전자를 분리 할 수 있었다. 이들은 8.5 kb 와 11.5 kb 의 BamHI 염색체 절편에 각각 존재하였고, 이것들을 갖고 있는 plasmid 의 이름을 pCF85 와 pCF115 라 명명 하였다. pCF85 에 존재하는 유전자는 기질로 p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside 와 cellobiose 를 분해 할 수 있는 효소를 만들수 있었으나, pCF115 가 만드는 효소는 p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside 만을 분해 할 수 있었다. Southern hybridization 실험에 의해서 이들 두개의 유전자는 동일한 유전자가 아님을 알아냈다.
한편, 이들 두개의 유전자는 각각 plasmid 내에 방향이 반대로 존재할때, 형질전환된 대장균 내에서 β-glucosidase 효소의 생산양에 영향을 미치는 결과를 보여주었다. 이러한 사실로 미루어 볼때, 유전자 운반체로 사용한 pUC9 plasmid 내에 존재하는 lac Z promoter 가 대장균 내에서 이들 유전자의 발현에 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다. 재조합 plasmid pCF85 내에 존재하는 유전자만이 기질로 cellobiose 를 분해하므로, 이 유전자에 관심을 갖고서 8.5 kb BamHI 염색체 절편의 크기를 줄여 나갔다. 이 때 재조합 plasmid 내의 염색체 절편의 크기가 줄어듦에 따라서, 형질 전환된 대장균 내에서의 β-glucosidase 의 생산에 큰 영향을 나타냄을 알았다.
pCF85 로 부터 염색체 절편의 크기를 줄인 재조합 plasmid pCF18 내에 존재하는 유전자에 의해 대장균으로 부터 만들어진 효소는 cellobiose 로부터 산물로 포도당만을 만드는데 관여한다는 것을 thin layer chromatography 에 의해 밝혔다. 따라서, pCF85 내에 존재하는 유전자는 한분자의 cellobiose 로부터 2분자의 포도당을 만드는데 관여 하는 효소인 β-glucosidase 를 coding 하는 유전자로 확인이 되었다.
재조합 plasmid pCF18 을 갖고 있는 형질 전환된 대장균으로 부터 4단계의 크로마토그라피를 거쳐 약 40배의 정제율과 약 24%의 회수율로 효소를 정제 하였다. SDS-polyacrylamide gel 에서의 전기 영동과 gel filtration chromatography 의 결과로 이 효소는 monomeric subunit 라는 것을 알았다. 분리된 효소의 등전점 (pI)은 4.1 이었다. 이 효소는 β-1,4-linkage를 갖는 기질에 선택적으로 작용하여 lactose, cellobiose, pNPG, pNPC 등을 분해 할 수 있었으나, α-linkage 를 갖는 maltose 는 분해 할 수 없었다. 이 효소의 역가는 Fe, Cu, Hg 와 같은 중금속에 의해서 크게 저해 되었고, 항상화제인 dithiothreitol 을 넣어 주었을때 역가가 증진되는 효과를 나타내었으므로 이 효소내에 존재하는 -SH 기가 중요한 역할을 하고 있었음을 알 수 있었다.
pCF85 에서 분리한 이 유전자의 크기를 줄여 최종적으로 1.8 kb로 만든후 Sanger 등의 "dideoxy chain termination" 방법에 의해 DNA의 염기 배열 순서를 결정하고 그것의 특성을 살펴 보았다. $\underline{Cellulomonas fimi}$ β-glucosidase 의 유전자는 translation 개시 codon 인 ATC로부터 시작하고 종결 codon 인 TGA 까지는 1,452 염기들로서 ORF (open reading frame) 을 이루고 있었다. DNA 염기서열 순서로 부터, 효소는 482 아미노산 잔기 (처음의 Methionine 잔기 제외) 들로 이루어지고 그 분자량은 54,329 dalton 으로서 예상되었으며, 앞에서 SDS-PAGE 로 부터 구한 정제된 효소의 분자량 56,000 dalton 과 유사하였다.
$\underline{Cellulomonas fimi}$ β-glucosidase 유전자의 염기 배열 순서로부터 예상되는 아미노산 배열 순서를 알려진 다른 종으로 부터 유래한 β-glucosidase 와 단백질 수준에서 비교하여 본 결과, 곰팡이나 효모에 존재하는 것과는 유사성을 나타내지 않았으나, Gram-negative 세균인 Agrobacterium sp. 와는 약 37% 의 유사성을 나타냈다. 특히, 효소의 N-말단 (51.0% 의 유사성) 과 C-말단 (45.4% 의 유사성) 에서 높은 유사성을 나타냈고, 성질이 유사한 아미노산으로 대치 된것 까지 허용하면 유사성의 정도는 N-말단이 84% 그리고 C-말단이 76% 의 유사성을 보였다. 이 유전자의 codon 사용은 보고된 $\underline{Cellulomonas fimi}$ 의 다른 cellulase 유전자와 비슷하였고, 이 유전자 내의 Guanine 과 Cytosine 함량은 71.2% 로 나타났다.
Translation 개시 codon 인 ATG 앞에는 ribosome 결합 장소인 Shine Dalgarno sequence 로 보이는 것이 존재하였고, 또한 대장균에서 promoter 로 사용하는 consensus sequence 는 없었으나, C. fimi의 다른 cellulase 유전자에서 제안된 것과 유사한 염기배열이 존재하였다. 한편, 종결 codon인 TGA 뒤에는 transcription 을 종결시키는 머리핀 구조를 이루는 4개의 inverted repeats sequence 가 존재하였다.
