For the production of exopolysaccharide pullulan with $\underline{Aureobasidium}$ $\underline{pullulans}$, the physiological factors influencing the production of exopolysaccharide, rheological properties of fermentation broths, development of new alternative carbon sources, and mutagenesis of $\underline{A}$. $\underline{pullulans}$ with MNNG were investigated. The utilization of various sugars was examined. Among them, sucrose gave the best result for the exopolysaccharide production, 27.5 g/l from 5% sucrose. The specific growth rate and specific production rate of exopolysaccharide were inhibited by the sugar concentrations higher than 0.29 M for glucose and maltose, 0.14 M for sucrose. By a fed-batch fermentation, 58.0 g/l of exopolysaccharide was obtained from total 10 % sucrose. The cell growth and exopolysaccharide production were greatly influenced by the pH and nitrogen content of fermentation broth. Especially the morphology of cells was dependent on the pH of fermentation broth. Around pH 3.0, cell growth was maximum and mycelial growth was predominant. The exopolysaccharide biosynthesis seemed to optimal about pH 4.5. But the maximum production of exopolysaccharide was achieved under the initial pH 7.5 without pH control. The air supply to cells was necessary to maintain or accelerate the overall metabolic activities of cells for the exopolysaccharide production.
Rheology of fermentation broths changed from Newtonian to non-Newtonian fluid by the accumulation of exopolysaccharide and well expressed as power-law equation. About 10% in the viscosity of fermentation broth was attributed by the cells.
The cell growth, exopolysaccharide production, and substrate consumption were generally expressed by the kinetic model equations. Especially the rheological parameters had the relationship with the concentrations of exopolysaccharide produced.
As alternative carbon sources, the utilization of starch hydrolysate and inulin was examined. From 5% starch hydrolysate (DE 75), 17.0 g/l of exopolysaccharide was obtained. In the case of inulin, a mixed culture technique with the delayed inoculation of $\underline{K}$. $\underline{pullulans}$ as an inulase producer was introduced. From 5% inulin, 17.5 g/l of exopolysaccharide was obtained and from 5% carbohydrate of Jerusalem artichoke extract, 15.5 g/l of exopolysaccharide was produced.
Mutant W 1076 strain was isolated by the mutagenesis of $\underline{A}. $\underline{pullulans}. This mutant showed the increased exopolysaccharide production and did not produce the melanin like black pigment.
불완전 곰팡이의 일종인 $\underline{Aureobasidium}$ $\underline{pullulans}$에 의한 세포외 다당류 풀루란의 생산에 관한 연구를 수행하였다. 풀루란의 생산에 영향을 미치는 생리적 인자, 배양액의 물성, 새로운 탄소원의 개발 및 균주계량을 위한 돌연변이 연구를 수행하였다.
(1) $\underline{A}$.$\underline{pulluans}$에 의한 풀루란 발효는 균체성장은 $\frac{dX}{dt}=μX (1 -\frac{X}{X_max})$ 식을, 다당류의 생성은 $\frac{dS}{st}=-α\frac{dX}{dt}-β(X)$ 식을, 기질소비는 $\frac{dP}{dt}=nX+m\frac{dX}{dt}$ 식으로 잘 표현될 수 있었다.
(2) 탄소원으로서 조사한 glucose, fructose, maltose, sucrose, 및 maltotriose 는 각기 독특한 분해 이용패턴을 보여주었으며 풀루란의 생산에는 sucrose 가 가장 높은 생산성을 보여주어 5%(w/v) 로부터 27.5% g/l 의 다당류를 생산하였다. 특히 이당류 이상의 경우 당의 가수분해 활성과 동시에 전이효소 활성이 나타났다. $\underline{A}.$ $\underline{pullulans}$가 고농도의 glucose, maltose, sucrose 에 의해서 억제되는 농도는 각각 0.29 M (5%), 0.29 M (10%), 0.15 M (5%) 이상의 당 농도였다. 고농도의 당을 이용하기 위하여 연가식 발효법을 도입하였으며 최종 10 % 의 sucrose 로부터 58.0 g/l 의 다당류를 생산할 수 있었다. 균체의 성장과 플루란의 생산은 배양 초기 p H 에 크게 영향을 받았는데 초기 p H 3.0 에서는 최대의 균체성장을 보였으며 이때 균체는 균사형태의 성장을 하였고 초기 p H 7.5 부근에서는 최대의 풀루란 생산성을 보였으며 이때 균체는 효모 형태의 성장을 하였다. p H 조절 실험과 p H 이동 실험을 통하여 p H 4.5 부근이 풀루란 생산에 좋은 것으로 나타났으며 p H 2.5 에서 얻은 균사형태는 p H 7.5 에서 얻은 효모형태보다 p H 4.5 에서 배양할때 다소 낮은 풀루란 생산성을 보여주었다. 배지 질소원의 농도에 의해서 탄소원이 균체성장이나 풀루란생성으로 이용되는 것이 조절되었다. 사용한 탄소원은 높은 질소원 농도에서는 균체성장이 우선적으로 일어났고 낮은 질소원 농도에서는 풀루란 생성이 우선적으로 일어났다. 풀루란의 생산은 교반과 통기에 의해서 크게 증가되었는데 이는 균체성장과 풀루란의 생산이 용존산소의 공급에 의존하고 있음을 보여주었다.
(3) 발효 초기에 배양액은 뉴-톤성 물성을 보여주었고 발효시간이 경과함에따라 비뉴-톤성 유체특성으로 바뀌었다. 이러한 풀루란 발효액의 물성은 power-law 로 나타낼 수 있었고 발효시간의 경과와 더불어 풀루란이 축적됨으로써 비뉴-톤성 지수 (n) 은 0.2 까지 떨어졌고 점조도지수 (K) 는 10 까지 증가되었다. 균체가 배양액의 점도에 미치는 정도는 $n_{a,cell}=0.229X-0.169$ 로 나타났으며 균체에의한 배양액의 점도의 증가는 약 10 % 를 차지하고 있었다. 풀루란 생성양(P) 과 power-law 지수(n,K) 사이에는 $ln K(t)=ln(τ_o)-n(t) ln(\gamma_o)$와 $K = A(p)^B$ 의 관계가 있음을 알 수 있었다.
(4) 풀루란 생산을 위한 새로운 탄소원으로서 전분과 이눌린의 이용을 시도하였다. 전분 이용의 경우는 가수분해 정도는 DE 75 정도가 풀루란 생산에 가장 좋았으며 5% 로 부터 전환율이 최고 34% 인 17 g/l 의 풀루란을 생산할 수 있었다. 이눌린 이용의 경우는 $\underline{A}$.$\underline{pulluans}$의 inulase 활성이 너무 낮아 이용이 불가능하였다. 이를 극복하기 위해 $\underline{K}.$ $\underline{fragilis}$를 inulase 생산 균주로 하는 혼합 배양을 행하여 5% 이눌린으로부터 최고 17.5 g/l 의 풀루란을 생산할 수 있었다. 이때 두 미생물의 상호 성장의 조절이 필요하였으며 이것은 $\underline{A}$. $\underline{pullulans}$를 접종한 다음 $\underline{K}$. $\underline{fragilis}$ 를 10 시간 후에 접종하므로써 $\underline{K}$. $\underline{fragilis}$ 에 비하여 $\underline{A}$. $\underline{pullulans}$ 의 수를 우세하게할 수 있어 풀루란의 생산을 증가시킬 수 있었다. 또한 혼합 배양의 경우 질소원을 조절하므로써 미생물의 대사 속도를 조절할 수 있어 풀루란의 생산을 더욱 증가시킬 수 있었다. 5 % 탄수화물 함량의 돼지감자 추출물로부터 15.5 g/l 의 풀루란을 생산할 수 있었다.
(5) $\underline{A}$. $\underline{pullulans}$배양중 멜라닌 계통의 검은 색소가 생성되어 풀루란과 단단히 결합하기 때문에 풀루란의 탈색공정에 어려움이 있다. 이를 극복하기 위하여 MNNG 를 이용한 돌연변이 연구를 행하였다. Blastospore 는 단 하나의 핵을 가지고 있었고 영양배지에서 2 시간 발아를 유도하였을때 MNNG 에의한 손상이 증가되었으며 최적처리 pH 는 7.0 (Tris-malate 완충용액) 이었다. 돌연변이를 통하여 선별된 W 1076 은 풀루란 생산성이 증가되었을 뿐만아니라 멜라닌 계통의 색소도 거의 생산하지 않아 우수한 균주로 판명되었다. $\underline{A}$. $\underline{pullulans}$의 흑색 색소의 생성은 동물이나 다른 곰팡이와는 달리 phenol oxidase 에 의하여 일어나지는 않는 것으로 나타났다.
