This study was performed to provide enzymological information which will be needed for the further development in molecular genetics of endo-β-1, 4-glucanase (EC 3.2.1.4) gene, whose product is known to be a member of the cellulase complex. And endo-β-1,4-glucanase gene of $\mbox{\underline{Bacillus}}\quad {\mbox{\underline{subtilis}}$ was previously cloned in $\mbox{\underline{Escherichia}}\quad \mbox{\underline{coli}}$ and subsequently introduced into a cellulase-negative strain of $\mbox{\underline{B.}}\quad \mbox{\underline{megaterium}}$ using a recombinant plasmid pCK98 in our laboratory. Using the new transformant, $\mbox{\underline{B.}}\quad \mbox{\underline{megaterium}}$ (pCK98), the endo-β-1,4-glucanase was produced and used for this study.
The enzyme was purified by chromatography including DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-100, and SP-Sephadex C-50. Since the host strain of $\mbox{\underline{B.}}\quad \mbox{\underline{megaterium}}$ was primarily cellulase-negative, only one protein peak on the chromatography showed cellulase activity which is believed to be encoded by the $\mbox{\underline{B.}}\quad \mbox{\underline{subtilis}}$ glucanase gene, and thus could be isolated easily. The purification procedures yielded a 215-fold purification of the enzyme with 15% recovery of the original activity.
The purified enzyme was found to be a monomer having molecular weight of 33,000 and contained 5.2% carbohydrate but no metal ion. The isoelectric point of the enzyme was at pH 7.23. The endoglucanase was high in small-nonpolar amino acid residues and low in bulky-aromatic residues. The three consecutive amino acid sequence at the N-terminal of the enzyme was found to be Ala-Gly-Thr. The signal peptide was composed of 29 hydrophobic amino acid residues. The enzyme displayed an absorption maximum at 278 mm with a molar absorption coefficient of $15,000 M^{-1} cm^{-1}$. The maximum hydrolytic activity of the endo-β-1,4-glucanase was observed at pH 5.5 and at 60℃. The enzyme was completely inactivated after 1 h preincubation at 65℃. The energy of activation for the enzyme was 5.2 Kcal/mole. The enzyme was sensitive to $Ag^{+}$, $Hg^{++}$, $Zn^{++}$, $Cu^{++}$, but not to $Ca^{++}$, EDTA, and many other monovalent cations. The values of Km and Vm of this enzyme for carboxymethyl cellulose (CMC) were 0.16% and 480 units per mg protein, respectively. The Km and Vm for pnitrophenyl cellobioside (PNPC) hydrolysis were 2.82 mM and 12 units per mg protein, respectively. The pK values of the free enzyme were estimated to be 5.25 and 7.30, and those of the enzyme-substrate complex were 5.03 and 7.42, respectively. The endo-β-1,4-glucanase was not affected by the treatment with iodoacetic acid, but the modification of enzyme with carbodiimide and diethylpyrocarbonate resulted in a marked loss of the enzyme activity. These results suggest that the active site of enzyme essentially contain carboxylic and imidazole groups of amino acid residues.
This enzyme hydrolyzed cellooligosacchrides having more than two glycosyl bonds and CMC at increased rates with the increase of chain length. In all cases tested, cellobiose was the main product and small amount of glucose was also detected among the end products. Involvement of transglycosylation in hydrolytic activity of this enzyme was confirmed. In PNPC hydrolysis, cellobiose was inhibitory to the enzyme.
The enzymes produced by $\mbox{\underline{E.}}\quad \mbox{\underline{coli}}$ (pBSl) transformant were equally localized in periplasmic and cytoplasmic space and its molecular weights were found to be about 33,000 and 55,000, respectively. From these results it could be postulated that both signal peptide and inner C-terminal portion of the primary translation product would be cleaved when the protein passes througy/through out the inner membrane. Nevertheless, substrate specificity and other properties were similar to each other.
섬유소를 분해하여 에너지원화 시키기 위한 연구가 많이 진행되어 왔다. 이의 분해는 일련의 몇개의 효소에 의하여 가능한데, 본 연구는 그중 하나인 endo-β-1, 4-glucanase 의 효소학적 정보를 얻기 위하여 수행되었다. 이는 또한 섬유소 유전자의 분자유전학적 연구에 요구되는 중요한 정보를 제공하여 줄 수 있다. $\mbox{\underline{Bacillus}}\quad \mbox{\underline{subtilis}}$ 의 endoglucanase 유전자가 본 실험실에서 대장균으로 cloning 되었고, 또 섬유소 분해능을 전혀 갖고 있지 않은 균인 $\mbox{\underline{B}}.\quad \mbox{\underline{megaterium}}$ 으로 다시 옮겨졌다. 이 형질 전환된 $\mbox{\underline{B}}.\quad \mbox{\underline{megaterium}}$ 으로 부터 효소를 분리 정제하고, kinetics, 반응 양상및 특이한 C-말단기의 절단등에 관한 특성에 대하여 조사하였다.
효소는 3 단계의 크로마토그래피로 비교적 용이하게 분리 정제 되었으며, 약 15% 의 회수율을 보였다. 정제된 효소는 단일 분자로 분자량은 33.000 이고, 5.2% 의 탄수화물을 함유하고 있었다. 이 효소의 등전점은 7.23 이고 금속 이온을 함유하지 않은 것으로 밝혀졌다. 이 효소는 작고 비극성인 아미노산의 양이 비교적 많았으며, N-말단의 아미노산 배열은 Ala-Gly-Thr-으로, 29 개로 이루어진 signal peptide를 지닌 것으로 판명되었다. 이 효소의 최적 pH 와 온도는 각각 5.5, 60℃ 로 나타났으며, $Ag^{+}$, $Hg^{++}$, $Zn^{++}$, $Cu^{++}$ 등에 의해 활성이 저해 되었다.
이 효소의 섬유소 (carboxymethyl cellulose) 와 PNPC (pnitrophenyl cellobioside) 의 분해능에 대한 Km 과 Vm 값은 각각 0.16%, 480 단위, 그리고 2.82 mM, 12 단위 (단백질 mg 당) 로 나타났다. 유리 효소(free enzyme) 과 효소-기질 복합체의 pk 값은 5.25, 7.30, 그리고 5.03, 7.42 로 결정되었으며, carbodiimide 와 diethylpyrocarbonate 에 의해 효소 활성이 거의 완전히 저해됨으로 미루어, 촉매 활성 부위에 carboxy 와 imidazole군 (group) 이 관여 한다는 사실을 간접적으로 알수 있었다.
이 효소는 β-1, 4-결합에 대해 특이성을 보였으며, 2개 이상의 glycosyl 결합을 갖는 섬유소 조각들 (cellooligosaccharides) 을 분해할 수 있었다. 또한 결합 길이가 길어질수록 반응이 빨랐으며, 이들의 주요 산물은 cellobiose 이었다. 반응산물의 분석으로 분해 양상은 직접 분해 (direct cleavage) 보다는 transglycosylation activity 에 의하여 진행된다는 사실을 알수 있었다.
형질 전환된 대장균 ($\mbox{\underline{E}}.\quad \mbox{\underline{coli}}$ pBS1) 은 cytoplasm 과 periplasm 에 거의 동일 양의 효소를 지니고 있었으며, 이들의 부분 정제된 효소의 분자량은 각각 55,000 과 33,000 으로 나타났다. 모균인 $\mbox{\underline{B}}.\quad \mbox{\underline{subtilis}}$가 분비한 효소의 분자량은 33,000 이었다. 이 결과로 부터 효소가 안쪽의 세포막(inner membrane) 을 통과할때 또는 통과한 후 C-말단 부분의 상당부분이 절단된다는 사실을 알수 있었다. 분자량의 많은 차이에도 불구하고 기질 특이성, pH와 온도에 대한 효과등 여러 물리, 화학적 성질은 거의 비슷하게 나타났다.
