In order to open a way for economical saccharification of the natural cellulose, amplification of a microbial cellulase gene using recombinant DNA technique was attempted.
A cellulolytic spore-former was isolated from heat treated compost, identified as $\underline{Bacillus}$ $\underline{subtilis}$, and used as gene donor. From the $\underline{Bacillus}$ isolate a new cellulase gene was cloned into $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ HB101 using pBR322 as a vector. Two different types of recombinant plasmids were isolated from the carboxymethyl cellulase (CMCase) positive transformants and named pBS1 and PBS2. CMCase genes were found to be located in 3.2- and 3.5 kb PstI fragments, of the respective plasmids. The 3.2- and 3.5 kb chromosomal inserts had the same restriction patterns, but their orientations were in opposite. DNA hybridization experiments showed that the two inserts were homologous and the 3.5kb fragment seemed to be derived from the 3.2 kb fragment through recombination with $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ chromosomal DNA in vivo.
The CMCase gene was expressed independently of its orientation in the cloning vector pBR322 showing enzyme production 40 times more than the original $\underline{Bacillus}$ species. The high production of CMCase in E. coli by the foreign gene did not impede growth of the host cells. The $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ transformants secrete only 5% of their total CMCase into the medium and the remaining 95% was shared equally in periplasmic and cytoplasmic compartments.
The CMCase produced by $\underline{E.}$ $\underline{coli}$ HB101 (pBS1) hydrolyzed CMC (1,4-β-D-glucan) and lichenan (1,3-1,4-β-D-glucan) powerfully, but did not show any hydrolyzing activity to laminarin (1,3-β-D-glucan), pustulan (1,6-β-D-glucan) and starch (1,4-α-D-glucan). The CMCase showed typical endoglucanase kinetics; caused a rapid decrease in viscosity with linear increase of reducing sugars in CMC solution. The CMCase produced by the E. coli transformants responded to various pH values and temperature in the same way as that produced by the gene donor cells, showing the highest activities at pH 5.5 and at 60℃. The electrophoretic mobility of the purified CMCase from osmotic shock fluid of HB101 (pBS1) indicated a molecular weight of 33,000.
The $\underline{Bacillus}$ CMCase gene could be localized in a 1.6 kb fragment by a series of subcloning experiments. However, the 1.6kb fragment seemed to have a partially damaged control region. The nucleotide sequence of the CMCase gene was determined by using the Sanger 'dideoxy chain termination sequencing' method. The putative ATG initiation codon was preceded by an AAGGAGG sequence, typical of Shine-Dalgarno-type ribosomal binding sites. The sequences TAGACA and TACAAT related to the consensus promoter sequences TTGACA (-35 region) and TATAAT (-10 region), respectively, were also observed, and the spacer between the two regions, 17 bp, corresponds well to those of other known $\underline{Bacillus}$ promoters. An A+T-rich region was found upstream from -35 region. From the putative ATG initiation codon, an open reading frame of about 1.3 kb was observed, however, termination codon has not been detected. This open reading frame exceeds the expected size of the CMCase structural gene, 0.8-0.9 kb, by far. A plasmid having the 1,004 bp open reading frame from the putative ATG initiation codon was derived from pUBS101 by using HinfI. This plasmid coded an active CMCase.
지구상에 가장 풍부하게 존재하며 또한 매년 재생산이 되는 바이오매스 (biomass) 인 섬유소 (cellulose)자원을 포도당이나 알코올과 같은보다 유용한 물질로 전환하기 위해 물리적, 화학적, 생물학적 측면 에서많은 연구가 진행되어 왔다. 그중 섬유소 분해능을 갖는 미생물을 이용하는 생물학적 방법이 주목을 받아 왔으며 여러가지 미생물들이 자연계로 부터 분리되어 그들의 생리및 응용에 대한 연구가 이루어져 왔다. 그러나 섬유소 물질은 분해되기 어려운 결정구조를 가지고 있고 몇가지 효소가 유기적으로 작용을 해야 그 기본 구성물인 포도당으로 분해되기 때문에 자연계의 미생물에 의한 분해 속도가 느리며 아직 경제적으로 이용 가치가 있는 분해 방법은 개발되지 못한 상태이다.
본 연구는 유전자 재조합 방법(recombinant DNA technique) 을 이용하여 섬유소 분해능을 갖는 미생물로 부터 섬유소 분해 효소 유전자를 크로닝하고 그 염기 배열을 분석함으로써 그에 대한 유전 정보를 알아내고 나아가 섬유소를 효율적으로 분해할 수 있는 섬유소 분해 효소 유전자 복합체의 창조와 효소의 대량 생산을 위한 기초를 마련하는데에 그 목적이 있었다.
퇴비로 부터 내생포자를 형성하며 우수한 섬유소 (carboxymethyl cellulose) 분해능을 갖는 균주를 분리하여 몇가지 특성을 조사한 결과 $\underline{Bacillus}\; \underline{subtilis}$(고초균) 로 판명되었다. 이 $\underline{Bacillus}$ 균주로 부터 새로운 섬유소 분해 효소 유전자 (carboxymethyl cellulase (CMCase) gene) 를 대장균 내에 크로닝 하였다. 이때 pBR 322 플라스미드를 벡타로 사용하였다. CMCase를 생산하는 대장균 형질 전환체로 부터 두 종류의 재조합 플라스미드 pBSl과 pBS2를 분리하였는데 조사 결과 각각 3.2Kb와 3.5kb의 DNA inserts에 CMCase 유전자가 들어 있었다. 그러나 이들 두 inserts는 벡타에 연결된 방향과 크기가 다를 뿐 동일한 제한효소 패턴을 보여 주었다. DNA hybridization 실험 결과 이들 두 inserts는 homologous 하였고, 3.5Kb insert는 3.2 Kb insert가 대장균내 에서 대장균의 염색체 DNA와 재조합되어 생겨난 것으로 보여졌다.
이렇게 크로닝된 $\underline{Bacillus}$ CMCase유전자는 대장균내 에서 자체의 promoter를 이용하여 잘 발현되어 모균인 $\underline{Bacillus}$ 균주보다 약 40배많은 CMCase 를 생산하였다. 그러나 외부 유전자에 의해 이렇게 많은 CMCase 를 생산하지만 대장균의 성장에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. $\underline{Bacillus}$ 균주가 CMCase 를 100% 세포 밖으로 분비하는데 반해 대장균에 의해 생산되는 CMCase 는 약 5% 만이 세포밖으로 분비되고 나머지는 cytoplasm 과 periplasm 에 같은 정도로 분포되어 있었다.
대장균에 의해 생산되는 CMCase 의 기질 특이성을 조사한 결과 CMC (1,4-β-D-glucan)뿐만 아니라 lichenan (1,3-1,4-β-D-glucan) 도 잘 분해함을 알수 있었다. 그러나 laminarin (1,3-β-D-glucan) 과 pustulan(1,6-β-D-glucan)그리고 전분 (1,4-α-D-glucan) 은 분해하지못했다. 따라서 이 CMCase는 β-1,4-linkage 에 대해 특이성을 갖는 것으로 보여졌다. 이 CMCase 를 1% CMC 용액과 반응 시키면서점도 감소와 환원당 증가를 조사한 결과 endo 타입의 glucanase 임이밝혀졌다. 즉, 점도는 초기에 급격히 감소하여 20 분 후 부터는 매우 완만한 감소를 보이는 반면, 환원당은 일정한 비율로 계속 증가함을 보여주었다. 대장균에 의해 생산되는 CMCase와 $\underline{Bacillus}$ 모균에의해 생산되는 CMCase 의 pH및 온도에 대한 활성을 변화를 조사한 결과 똑같은 경향을 나타냈고, pH 5.5 및 60℃ 에서 최상의 활성을 나타내었다. 대장균의 periplasm 으로 부터 분리 정제한 CMCase 를 SDS-polyacrylamide gel 상에서 전기 영동하여 분석한 결과 분자량이 약 33,000 인 것으로 나타났다.
일련의 subcloning 실험을 통해 CMCase 유전자를 1.6 Kb 의 DNA 조각내에 국한시킬 수 있었다. 그러나 이 과정에서 promoter 부위가 손상된 것으로 나타났다. Sanger 의 'dideoxy chain termination sequencing' 방법에 의해 CMCase 유전자의 염기 배열 순서를 결정하였다. Consensus promoter 염기 배열인 TTGACA (- 35 부위) 및 TATAAT (- 10 부위) 에 해당되는 TAGACA 및 TACAAT 염기 배열을 발견했고 이 두 염기 배열 사이의 거리는 17 bp로서 다른 $\underline{Bacillus}$ promoter 의 경우와 부합하는 결과였다. 또한 -35 부위 앞쪽에 A+T 염기 밀집 지역이 존재하였다. 전형적인 Shine-Dalgarno 유형의 리보좀 결합 장소인 AAGGAGG 염기배열 및 이로 부터 14 bp 아랫쪽에 translation 개시 codon으로 여겨지는 ATG 염기 배열을 발견하였다. 이 ATG codon으로 부터 1.3 kb 정도의 operon reading frame (ORF)이 존재하였다. 그러나 translation 종결 codon 은 발견되지않았다. 이 ORF 는 CMCase 구조 유전자의 예상 크기인 0.8 - 0.9 kb를 훨씬 초과하는 크기이다. Hinf I 제한효소를 이용하여 ATG codon으로 부터 1,004 bp 의 크기를 갖는 ORF 를 subcloning 하여조사한 결과 활성이 있는 CMCase 를 생산해 냄을 알았다.
