Genes, which make their host resistant to lambda, were isolated from $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{albidum}$ ATCC15831 and $\underline{Proteus}$ $\underline{vulgaris}$ ATCC13315 and introduced into $\underline{Escherichiacoli}$ HB101. The clones transformed by one of the recombinant plasmids, pRMG101 or pRMG216, were totally resistant to virulent lambda and N4, but sensitive to 080, T4, and T7. $\underline{E}$. $\underline{coli}$ HB101 (pRMG101) was still resistant even when the cell was mixed with 30 times excess numbers of the phages, lambda and N4.
Radioactively labelled plasmid DNAs, the pRMG101 and pRMG216 were hybridized to the chromosomal DNAs of $\underline{P}$. $\underline{vulgaris}$ DNA and $\underline{B}$. $\underline{albidum}$, respectively, indicating that the inserted foreign DNA fragments possessing lambda and N4 resistant activities in pRMG101 and pRMG216 were those bacterial organisms.
There were no type Ⅱ restriction activities found in the extracts of $\underline{E}$. $\underline{coli}$ HB101 (pRMG101) or B. coli HB101(pRMG216) which were fractionated by heparinagarose column chromatography. While the two modification activities were detected from the extract, lambda DNA methylated by these modification enzyme were completely digested by each one of the endonucleases, Bal Ⅰ, BamH Ⅰ, Pvu Ⅰ, Pvu Ⅱ, and Xba Ⅰ. Furthermore, a recombinant plasmid, pRMG101, was completely digested by Pvu Ⅰ or Pvu Ⅱ.
Sequenced nucleotides revealed that the genes in pRMG101 contained one transcriptional unit with a representative promotor region and two open reading frames of the sizing, 500 and 960 base pairs (gene A and gene B, respectively). The gene A alone could not exhibited the resistance to the phages. In the case of the gene B, we were not able to subclone the gene B without the gene A to the downstream of any functional promotors.
When phage DNAs were transfected into the clone carrying pRMG101AB (a subcloned plasmid) or pRMG216, not only Ø80 but also N4 and lambda DNA were propagate in the resistant clones.
$\underline{E}$. $\underline{coli}$ K-12(pUC9) and $\underline{E}$. $\underline{coli}$ K-12 (pRMG101AB) grew at almost the same rate in minimal medium containing glucose as a sole carbon source. But they grew on maltose or maltotriose medium at different rates, where the latter grew faster than the former. Furthermore, even $\underline{E}$. $\underline{coli}$ K-12(pRMG101AB) and $\underline{E}$. $\underline{coli}$ K-12 (pRMG216) became sensitive to N4 and lambda when the maltose transport system was induced by maltose.
Efficiencies of plating (e.o.p.) of three phages were determined on the lawns of $\underline{E}$. $\underline{coli}$ N145 strains which harbor pBR322, pBR322AB, or pRMG101AB. Both pBR322AB and pRMG101AB had the lambda resistant genes in pBR322 and pUC9 replicons, respectively. While $\phi$ 80 had same e.o.p. on any bacterial lawns, lambda and N4 showed significantly different e.o.p. depending on the used lawns. They exhibited no detectable e.o.p. on $\underline{E}$. $\underline{coli}$ N1445 (pRMG101AB). However, they gave e.o.p. of 0.61 and 0.41 on $\underline{E}$. $\underline{coli}$ N1445 (pBR322AB), respectively.
The products of the genes in pRMG101AB were shown by SDS-PAGE of membrane protein-enriched extract of the clone. The molecular weights of the proteins as measured were about 20,500 and 40,000 dalton, which are consistent with those deduced from the nucleotide sequences.
Proteus vulgaris ATCC 13315 와 Brevibacterium ATCC 15831로 부터 lambda 에 대해 내성을 갖게 하는 유전자 (lar: Lambda resistance) 를 분리하였다. 이 유전자를 포함하는 재조합 plasmid,pRMG series 로 대장균을 형질 전환시키면 그 대장균들은 전부 $\lambda_{vir}$와 N4 에 대해 내성을 갖게 되는 반면, $Φ80_{vir},$ T4, T7 에 대해서는 민감하였다. 이러한 형질은 30 배의 phage 를 감염 시켰을 때에도 여전히 나타났다.
pRMG101 에 cloning 된 유전자는 P. vulgaris 에서 부터, pRMG216 에 cloning 된 유전자는 B. albidum 에서 부터 얻어진 것임이 각각의 유전자와 박테리아의 전체 DNA 와 hybridization 결과 밝혀졌다.
pRMG101 에 cloning 된 유전자의 염기 서열을 밝혀 본 결과 이 유전자의 구조는 자신의 promoter ($P_{lar}$), 유전자 A, 유전자 B 의 순서로되어 있음을 확인하였다. $P_{lar}$는 대장균내 에서 promoter 로서의 기능을 할수 있었고, 유전자 A만으로는 $\lambda_{vir}$와 N4에 대해 내성을 갖지못하였다. 그런 반면 유전자 만 존재할 때 유전자 B 는 숙주를 죽이는 역할을 하는 것으로 사료된다.
그러나 대장균의 phage receptor를 maltose 로 증폭시키면 이들 유전자가 있음에도 불구하고 원래 대장균처럼 $\lambda_{vir}$와 N4에 대해 민감성을 나타내었다. 이는 maltose 에 의해 200배 가량 증폭된 lambda receptor에 비해 lambda resistant gene의 산물이 상대적으로 적어져 lambda 가 부착할 수 있는 receptor가 있기 때문인 것으로 여겨진다. 이러한 가정은 pRMG101 AB와 pBR322 AB (pBR322) 에 gene A, B 를 subcloning 한 plasmid)를 갖는 E. coli N1445 에 대한 lambda 의 plating efficiency 를 비교하였을때 일치하고 있었다. 즉 E. coli N1445 (pRMG101 AB)에 대한 lambda 와 N4 의 plating efficiency 는 거의 찾을 수 없었으나 E. coli N1445 (pBR322 AB) 에 대한 lambda 와 N4 의 efficiency 는 각각 0.61 과 0.41 이었다. 즉 유전자 A, B가 pCU9 에 있을때 보다 pBR322 에 있을때 plasmid copy 수가 적음에 따라 유전자의 산물로 적어져 나타난 것으로 생각된다.
이들 재조합 plasmid를 갖고 있는 대장균들로 부터 제한 변형 효소활성을 찾지 못하였고, P. vulgaris 가 갖고 있는 제한 효소인 Pvu I 과 Pvu II 에 의해 pRMG101 이 완전히 절단되었다. 이러한 몇가지 결과들로 부터 pRMG101 이나 pRMG216 에 cloning 된 유전자는 제한 - 변형 효소 유전자가 아님이 밝혀졌다.
pRMG101 AB 를 갖고 있는 대장균은 pUC9 vector 를 갖고 있는 대장균 보다 maltose 를 유일 탄소원으로 할때 훨씬 빠른 속도로 자랐다. 또한 $\lambda_{vir}, N4, Ø80_{vir}$의 phage DNA를 $\underline{E}$. $\underline{coli}$ HB101 (pRMG101 AB) 와 $\underline{E}$. $\underline{coli}$ HB101 (pRMG 216)에 transfection 시켰을때 phage DNA들은 phage resistant gene이 있음에도 불구하고, 그 대장균들 내에서 새로운 phage 를 만들수 있었다.
이상의 결과들로 부터 pRMG101 이나 pRMG216 에 cloning 된유전자는 N4 나 $\lambda$의 receptor 에 작용하여 phage 의 adsorption을 방해하고 따라서 phage 에 내성을 주는 것으로 밝혀졌다. 이 기작은 phage 에 내성을 갖는 균주의 membrane 단백질 만을 농축시킨 액을 SDS-PAGE 하여 유전자 A, B 의 산물을 20,500 과 40,000 으로 확인함에 따라 뚜렷해 졌다.
