The fall webworm, $\underline{Hyphantria}$ $\underline{cunea}$ Drury, an occasional pest on fruit and deciduous trees is one of the major forest pests in Korea. The fall webworm is susceptible to both a granulosis virus and a nuclear polyhedrosis virus. In view points of development for a viral insecticide of the fall webworm, the characteristics of H. cunea nuclear polyhedrosis virus should be available, that is meaningful criteria for identification and monitoring can be selected. Nevertheless, little is known about the molecular properties of this fall webworm pathogenic nuclear polyhedrosis virus.
Using virus of $\underline{H.}$ $\underline{cunea}$ was isolated from in our laboratories, the biochemical characteristics were investigated. The early sign of nuclear polyhedrosis virus infection of fall webworm was behavioral changes. The infected larvae refused to eat and became sluggish. Later, infected larval integument changed color from yellow-green to brown and skin became fragile and flaccid. Larvae at the advanced stage of the disease tended to clime to the top of plant or the container. They formed a kind of inverted V shape.
In general, the younger instar larvae were more susceptible than the older ones. A dosage of $10^6$ PIB/ml caused 83% mortality to second instar larvae and 67% mortality to third instar larvae. The $LT_{50}$ values of second and third instar insects for the dosage of $10^5$ PIB/ml were 6.85 and 15 days, respectively. Concerning species specificity, no pathogenic effect of this $\underline{H.}$ $\underline{cunea}$ nuclear polyhedrosis virus was observed to larvae of silkworm, Bombyx mori and pine caterpillar, $\underline{Dendrolimus}$ $\underline{spectabilis}$.
The isolated nuclear polyhedrosis virus of fall webworm replicated successfully in an established cell line of Trichoplusiani (TN-368), and serially passaged in this cell cultures. Hypertrophy of the nucleus was observed in a few cells as early as 6 h postinfection. Within 23 h postinfection, infection was noticeable as evidenced by the hypertrophy of nuclei and the presence of developing nuclear ring zone. The production and maturation of polyhedral inclusion body were usually completed by 72 h postinoculation. About 152 polyhedras were produced per cell and the polyhedral inclusion bodies produced in TN-368 cells showed to be pathogenic to the host larvae.
Electron microscopic observations of sectioned inclusion body revealed the presence of multienveloped virus particles within a crystalline inclusion body which normally ranged from 0.6 to 2.5 μm in diameter. Rod shaped virus particle was 320 nm length and 31 nm in width. Virus bundles contained 2-15 nucleocapsides and particularly 25 rods as maximum.
The polyhedra was purified by centrifugation on 25-65% linear sucrose gradients (the density was 1.21g/ml). A homogeneous band and microscopical examination exhibited the purity of polyhedral inclusion bodies.
One-tenth volume of 1M $Na_2CO_3$-0.5M NaCl for 30 min was a optimal condition for the polyhedra dissolution. The degradation activity was entensively inhibited by $Hg^{++}$ and $Cu^{++}$, but only 51% of activity inhibited by heat treatment at 100℃ for 2h. These results strongly suggested that the polyhedra of fall webworm nuclear polyhedrosis virus was degraded by the action of alkaline protease.
The polyhedra displayed 2 band profiles after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The major band was $35×10^3$ and minor band was $14×10^3$. The profiles of the viral protein revealed at lease 13 bands ranged from 15.5 to $98.0×10^3$ dalton.
The genome of $\underline{H.}$ $\underline{cunea}$ nuclear polyhedrosis virus was DNA and bigger than 100 kilobases. The digestion of the viral DNA with EcoRI exhibited at least 11 fragments.
To our knowledge, no cell culture of $\underline{H.}$ $\underline{cunea}$ have been developed, and this paper reports first successful replication and serial passages of fall webworm nuclear polyhedrosis virus in the continuous cell line of $\underline{Trichoplusia}$ ni. Our experience revealed that no significant differences in morphological, pathological, and biochemical properties were observed in the nuclear polyhedrosis virus preparations from infected host larvae and from tissue culture.
해충은 각종 농작물및 산림의 생산을 저해하는 가장 큰 요인으로 알려져 왔다. 따라서 해충을 방제하거나 구제하기 위하여 화학농약을 주로 사용해 왔으나 잔류 독성에 의한 인명및 가축의 피해가 늘어나고 환경이 오염되며 생태계가 파괴되는 등 많은 문제점이 대두되었다. 또한 해충의 저항성이 증가하여 소기의 목적을 달성하기가 어려워졌다. 바이러스를 이용한 해충 구제 방법은 숙주에 대한 특이성이 강하고 병원성이 높으며 인체를 비롯한 가축및 익충에 전혀 피해를 주지 않을 뿐 아니라 생태계도 파괴하지 않으므로 이에 대한 연구가 최근에 활발히 진행되고 있다. 그러나 곤충 바이러스에 관한 연구는 초기 단계 이므로 이에 대한 분자생물학적 연구가 미미한 상태에 있다. 곤충 바이러스의 특성에 관한연구는 바이러스의 분류및 동정에 이용될 뿐만 아니라 실제 사용했을 때 생태계에 어떤 영향을 미치게되는지를 추적하기 위해 반드시 필요하다.
따라서 본 실험에서는 우리나라 가로수및 활엽수에 치명적 피해를 주고 있는 흰불나방의 바이러스를 분리 검색하고 세포에서 배양하여 이를 이용한 분자생물학적 연구및 생화학적 특성을 고찰함 으로써 앞으로 흰불나방의 구제를 위하여 바이러스 살충제를 개발하는데 필요한 기초적 자료를 확립하고자 한다. 흰불나방 핵다각체형 바이러스의 특성에 관한 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 바이러스에 감염되어 죽은 흰불나방 애벌레로 부터 바이러스를 분리 정제하여 TN-368 세포에 감염시킨 뒤 배양하여 얻어진 바이러스는 병사한 흰불나방 애벌레에서 얻은 바이러스와 동일한특성을 지니고 있었다.
2. 일반적으로 애벌레의 나이가 어릴수록, 또 접종량이 많을수록 치사율이 높았다. 애벌레에 $10^6 PIB/ml$을 감염 시켰을때 2령의 애벌레는 83% 가 죽었고, 3령의 애벌레는 67% 가죽었다. $10^5 PIB/ml$의 바이러스를 접종시키면 2령 애벌레의 $LT_{50}$ 는 6.85일이었고, 3령 애벌레의 $LT_{50}$는 15일 이었다.
3. 곤충 바이러스는 숙주에 대한 특이성이 강하므로 누에나 송충이는 흰불나방 핵다각체형 바이러스에의해 감염되지 않았다.
4. 애벌레를 감염시키기 위해서는 다각체를 먹이에 살포하여 구강을 통해 섭취함 으로써 병이 유발되게하였고, TN-368 에 접종하기 위해서는 다각체로 부터 바이러스 입자를 추출하여 접종하여야만 배양된 세포에 감염이 가능했다.
5. 바이러스에 감염된 애벌레는 식욕이 줄고 운동성이 떨어지며 병이 진행됨에 따라 체색이 바뀌고 표피가 터져 내용물이 밖으로 유출되기도 한다. 나무 꼭대기나 사육상자 천정에 거꾸로 매달려 "V" 자를 뒤집어 놓은 형태로 죽기도 한다.
6. 바이러스에 감염된 TN-368 세포는 초기에 핵 부위가 증대되며, 세포가 둥글게 됨으로써 바이러스의 감염을 확인할 수 있는데 시간이 지남에 따라 핵 내부에 바이러스의 다각체가 형성되고 접종후 72 시간이 지나면 일부의 세포는 터져 다각체를 배양액 속으로 방출하며 대부분의 세포는핵 내부에 다각체를 포함한 상태로 배양기 벽에서 떨어져 배양액 내에 떠 있게 된다.
7. 흰불나방 바이러스를 전자현미경으로 관찰한 결과 다른 핵다각체형 바이러스와 형태적으로 유사함을 알았다. 다각체의 크기는 직경이 0.6 - 2.5 μm 이며 31×320 nm 크기의막대 모양을 한 바이러스 입자가 2 - 15 개씩 다발을 이루어 막에 싸인 형태로 다각체 내부에 산재하여 함입되어 있었다.
8. 흰불나방 바이러스의 핵다각체는 25 - 65% 농도 구배 sucrose를 96,000 ×9로 3 시간 원심분리 하여 하나의 단일 띠를 얻었는데 이의 밀도는 1.21 g/ml 이었다. 이 방법으로 얻어진 다각체를 현미경으로 관찰한 결과 순수 분리되었음을 확인하였다.
9. 바이러스의 다각체는 $0.1 M Na_2CO_3-0.05 M NaCl$ 용액으로 30분 처리하면 완전 분해되어 바이러스 입자를 다각체로 부터 방출하게 된다. 이때 알칼리 조건에서 작용하는 단백질 분해 효소가 존재함을 $Hg^{++}$와 $Cu^{++}$에 의한 반응 저해및 열처리로 인한 활성도상실 등 간접적 방법에 의해 확인할 수 있었다. 10. SDS 존재하에 전기 영동하면 다각체는 2개의 단백질 띠를 나타냈는데 $35×10^3$ 인주 구성 단백질과 $14×10^3$ 인 보조 구성 단백질 중 보조 구성 단백질은 알칼리성 분해효소에 의해 분해된 조각으로 생각된다.
11. 바이러스는 13 개의 단백질 띠로 분리되는데 분자량은 $15.5-98.0×10^3$ 이었으며, $37×10^3$ 인 것과 $25.3×10^3$ 인 단백질이 주종을 이루고 있었다.
12. 바이러스의 유전자는 DNA 이며 분자량이 $66×10^6$ 이상이다. Eco RI 에 의해 11개의 DNA 조각으로 분해됨을 agarose 전기 영동에 의해 알았다.
