Although there are many reaction systems to utilize the lipase more efficiently, the denaturation of the enzyme is one of the most serious problems to be solved in all systems tried to date. In order to maintain the enzyme activity it is important to understand the denaturation mechanisms. For the enzymatic production of fatty acids and the specialty lipids, properties of the lipase in organic solvent, which is necessary for solubilizing the water immiscible substrate, were studied.
The Candida rugosa lipase was purified to above 97%. Its molecular weight and isoelectric point were 52000±800 and 4.16, respectively, and amino acid of N-terminal was proline. The kinetics of the lipase deactiviation was found to be a complex process, which consisted of the three regions; 1) initial linear region (of overall deactivation), 2) transient region, and 3) last linear region. The following techniques confirmed the above mentioned result; the ratio of absorption at 278 nm to absorption at 250 nm, the change in the accessibility of the neutral quencher to Trp region, and the pattern of ANS binding to nonpolar groups of the lipase surface.
The kind of and/or density of surface charge of the lipase influenced its structure and activity, and Glu, Asp, and His were especially important in maintaining the native structure and in changing the structure during thermal treatment. This result was consistent with the change of the activity, UV spectrum, structure near Trp region, exposure of nonpolar amino acids, and the secondary structure of the Lipase during denaturation.
The increase in the ionic strength, which changes the interction between water and enzyme, increased the deactivation rate of the lipase during thermal treatment, but it made the hydrophobic region (containing Phe), Trp region, exposure of the nonpolar groups, and the secondary structure of the lipase to be less sensitive to heat treatment.
When less polar solvent was mixed with the lipase during heat treatment, the pattern of the structural change was different from that in the absence of the solvent. The change of intermediate polar region (containing Trp) was more significant than that of hydrophobic region. And the interaction between the lipase and organic solvent without heating caused the structure to be changed.
At lower concentration of urea, which changes the hydrophobic interaction of the lipase, the enzyme became sensitive to heat, but the changes of nonpolar groups, hydrophobic region, and activity became less sensitive to heat at higher concentration.
The lipase was found to be high in the surface hydrophobicity and in the charge density.
유기용매를 이용한 지방산과 특정지질 생성에, 효소를 이용하는 것이 매우 활발히 연구되고 있으며, 많은 반응계가 시도되고 있다. 그러나, 유기용매에 의해 효소의 안정성이 크게 저해를 받는 것은 극복되어야 할중요한 문제점중 하나이다. 이러한 안정성 유지를 위해 효소의 변성기작을 이해할 필요성 때문에, 본 연구에서는 Candida rugosa 리파제의 변성기작을 측정한 결과이다.
이 효소의 순도가 97% 이상으로 순수분리되어 사용 되었으며, 분자량은 52000±800, 등전점은 4.16, 그리고 N-terminal의 아미노산은 proline 이었다. 열에 의한 불활성 기작은 다음 3 단계로 구성된 complexprocess 이었다. 1) 일차적 반응에 근접한 초기 단계 (이 단계에서 변성의 대부분이 진행된다). 2) 복합적 반응을 나타내는 전이단계, 3) 일차적반응에 근접하여 변하는 마지막 단계로 구성 되었다. 이런 단계적 활성변화는, UV 흡광도에 의한 소수성 부분 (phenylalanine 을 포함) 의 변화, tryptophane 주위의 변화, 비극성 아미노산의 노출현상등에 의해, 구조적변화와 잘 일치됨을 발견했다.
활성 및 구조 변화가 효소 주위의 이온 종류나 밀도에 의해 크게영향을 받으며, 특히 glutamic acid, aspartic acid, 그리고 histidine 이원래의 효소 구조 형성 뿐만 아니라 변성과정에서 발생하는 구조적 변형과 밀접한 관계를 가진 것으로 판단 되었다. 이 결과는 활성 뿐만 아니라, UV흡광도 변화, tryptophane 주위의 구조 변화, 비극성 아미노산 노출현상, 그리고 효소의 2 차원적 구조변화에서도 위와 같은 현상이 관찰 되었다. 효소와 물의 관계에 영향을 주는 ionic strength 의 변화는, 열변성과정중에 활성변화를 촉진 했으나, phenylalanine 을 포함한 소수성 부분과 tryptophane을 포함하는 부분, 비극성 부분 그리고 2 차원적구조등의 변화를 억제하는 것으로 나타냈다.
비극성 정도가 큰 유기용매를 사용했을 경우는, 단순한 열변성 때와는 다른 구조적 변형 과정을 따르는 것으로 나타났으며, 특히 소수성 부분의 변화 보다는 중도적 친수성 부분이 크게 변화하는 것이었다. 또한 유기용매와 효소의 접촉만으로 구조적 변화에 크게 영향을 미쳤다. 효소의 분자내 소수성 결합에 영향을 주는 urea의 경우에는, 낮은 농도에서의 효소가 열처리에 민감했으며, 높은 농도에서는 비극성 부분, 소수성 부분 그리고 활성 변화가 열처리에 민감하지 않았다. 그 외에도 이 효소의 표면에 소수성 아미노산이 많이 노출되어 있으며, 이온화 정도도 높은것으로 나타났다.
