For enzymatic production of faty acids, the potential of reversed micelles as reaction system for the hydrolysis of triglycerides is investigated. Lipase from $\mbox{\underline{Candida}}$ $\mbox{\underline{rugosa}}$ can be solubilized in reversed micelles formed by bis (2-ethylhexy) soidum sulfosuccinate and water in isooctane and catalyze the hydrolysis of triglycerides, so that kinetic analysis of the lipase-catalyzed reaction is possible in this system. The enzyme obeys Michaelis-Menten kinetics in the investigated concentration range with Km, app value which is not substantially different from the finding in an aqueous emulsion system and neither are temperature effect and pH profile. Initial velocity of lipase in reversed micelles is 6 times faster than that in emulsion system, which may be due to the enormous interfacial area provided by the reversed micelles. Among various chemical compounds, $Cu^{2+}$, $Hg^{2+}$, and $Fe^{3+}$ inhibit the lipase severely, but its activity is restorable partially by adding histidine or glycine with the metals. The enzyme activity and stability are dependent on the molar ratio of water to surfactant (abbreviated as R) and R values which maximize initial velocity and stability are 10.5. and 5.5, respectively. Addition of glycerol to reversed micelles affects the activity in different fashion according to R.
Batch hydrolysis of olive oil by lipase in reversed micelles has also been carried out. Olive oil (5%, v/v or 0.1557 M as ester bond concentration) can be almost completely hydrolyzed at R value of 10 and at 100 mM AOT, since lipase from $\mbox{\underline{Candida}}$ $\mbox{\underline{rugosa}}$ has no positional specificity. Initial water concentration and R are found to be the very important factors that determine equilibrium fractional conversion and the hydrolyzing rate. The lipolysis rate and the stability of the enzyme are affected by stirring and addition of histidine or glycerol.
To interpret further the results of batch hydrolysis of oil in reversed micelles, effect of water on equilibrium is considered. When small amount of water is added during the hydrolytic reaction in reversed micelles, the hydrolysis rate is slightly enhanced and the reaction reaches a new equilibrium. Furthermore, equilibrium fractional conversion is affected by the initial water concentration, being shifted to higher values and the more so the higher the water concentration with other reaction conditions being held constant, indicating that the reaction should be regarded as a two substrate reaction. In order to determine how water affects the equilibrium and the rate parameters of hydrolytic reaction in reversed micelles, equations corresponding to two substrate second-order reversible kinetics are derived and used for further analysis. The progress curves predicted from the rate equations agree very well with the experimental data under various reaction conditions. The values of R which maximize the initial reaction rate and fractional conversion is predictable from the rate equations derived and the resulting relationship between R and kinetic constants. The calculated optimal R value was found to be consistent with the experimental results.
리파제를 사용하여 지방을 가수분해함으로써 지방산을 생산하기 위한 반응계로 역마이설계를 선택하였다. AOT(dioctyl sodium sulfosuccinate의 약칭)와 물의 존재하에서 유기용매에 용해된 리파제는 지방의 가수분해를 촉매할 수 있었다. 따라서 이 반응계에서 리파제 촉매반응의 반응속도론적인 분석이 가능하였다. 8가지 유기용매내에 형성된 역마이셀 용액중에 리파제의 반응속도는 반응매질이 이소옥탄일 때 가장 빨랐으며 이 효소의 반응최적 온도와 pH는 각각 30℃와 pH7.1이었다. 그리고 물농도가 0.89%일때 이 반응계에서 리파제의 올리브유에 대한 미카엘리스 상수와 최대 반응속도는 각각 1.0%와 1,020 units/ mg protein으로 나타났다. 여러가지 금속이온과 아미노산이 반응속도에 끼치는 영향을 조사한 결과 망간, 나트륨, 암모니움 이온 및 gum arabic은 효소역가에 영향을 거의 끼치지 않았으며 구리, 수은, 철 이온은 리파제를 심가하게 저해시켰다. 그러나, 저해효과를 나타낸 중금속 이온과 히스티딘이나 글리신등의 아미노산을 함께 첨가하면 효소는 부분적으로 활성을 회복할 수 있었다. 역마이셀계에서 리파제의 반응속도와 안정성은 모두 R값(물과 계면활성제의 물농도 비율)에 따라 변화되었는데 R값이 10.5일 때 초기 속도가 가장 빨랐으며 R값이 5.5일 때 가장 안정한 것으로 밝혀졌다. 한편, 역마이셀 용액에 글리세롤을 첨가하면 반응속도는 R값에 따라 서로 다른 양상으로 변화되었다.
역마이셀계에서 리파제의 특성에 관한 실험결과를 바탕으로 올리브유의 회분식 가수분해에 관한 연구를 하였다. R값이 10이고 AOT가 100mM이며 초기 물농도가 1.78%에서 올리브유의 함량이 전체 반응혼합물의 5%(에스테르 결합의 농도로는 0.1557 M)일 때 이 기질은 거의 안전히 가수분해되었다. 역마이셀 내의 초기 물농도는 가수분해 속도뿐만 아니라 평형 가수분해율 (equilibrium fractional conversion)에도 큰 영향을 끼치는 것으로 나타났다. 예를들면 30℃에서 30units의 리파제로 반응시켰을 때 4시간 후 가수분해율은 초기 물농도가 0.49%에서 2.63%로 증가함에 따라 40.5%에서 68.1%로 증가하였다. 한편, 반응계에 히스티딘을 첨가하거나 반응 혼합물을 교반하면 회분식 가수분해 속도는 증가하였으나 효소의 안정성은 이들 인자에 의해 오히려 악화되는 현상이 나타났다. 역마이설계와 에멀전계에서 올리브유의 회분식 가수분해 속도를 비교한 결과, 에멀전계와는 달리 역가상승제를 첨가하지 않고 반응혼합물을 교반하지도 않았으며 계면적을 증가시키는데 에너지도 거의 소요되지 않은 역마이셀계에서의 가수분해 속도가 더 빠른 것으로 나타났다.
역마이셀계에서 트리글리세리드의 회분식 가수분해 결과를 분석하기 위하여 물이 반응의 평형이 끼치는 효과를 조사하였다. 이제까지 가수분해 효소의 반응은 수용액상에서 이루어졌기 때문에 물이 반응의 평형에 끼치는 영향이 무시되었으나 역마이셀에서 리파제 반응의 평형은 초기 물농도에 따라 변화되었다. 즉, 가수분해 반응이 진행되고 있는 동안 역마이셀 용액에 소량의 물을 첨가하면 가수분해 속도가 약간 증가하였고 궁극적으로 평형의 위치가 바뀌는 결과를 나타냈다. 또 다른 반응조건이 일정하게 유지되었을 때에 평형가수분해율은 초기 물농도가 증가함에 따라 증가되는 경향이 나타났다. 물농도가 평형과 속도변수에 끼치는 영향을 수학적으로 표시하기 위하여 2차 가역적 반응속도론(two substrate second-order reversible kinetics)에 근거하여 가수분해율, 평형상수, 속도상수등을 나타내는 방정식을 유도하였고 이 식과 컴퓨터 프로그램을 이용?臼♭ 속도변수를 구하고 이 속도변수 값을 유도된 식에 대입하여 예측한 리타제 반응의 반응시간에 따른 가수분해율은 여러가지 실험조건하에서 실험결과와 잘 일치함을 알 수 있었다. 또한, 초기 속도와 평 형가수분해율을 최대화하는 R값을 속도상수와 R과의 관계식 및 유도된 방정식을 이용하여 예측할 수 있었다.
