A simple and rapid colorimetric method was developed to determine the lipase activity. Free fatty acids dissolved in isooctane were determined by observing the color developed(absorbancy) using cupric acetate-pyridine as a color developing reagent. The present method eliminates laborous solvent evaporation and centrifugation steps. It takes only a few minutes to determine the free fatty acids by this method, whereas it takes over 20 min by the conventional method. The sensitivity and reproducibility of the method were good for caproic, caprylic, capric, lauric, myristic, palmitic, stearic and oleic acids.
The effect of organic solvents on the stability and catalytic activity of the microbial lipase from Candida rugosa and Rhizopus arrhizus for fat splitting and interesterification in two phase system was studied, respectively. The solvents examined were 5 hydrocarbons (n-hexane, n-heptane, n-octane, isooctane, and cyclohexane). The results revealed that isooctane is superior to the other solvents examined for both lipases in two phase system and that cyclohexane and diisopropylether for C. rugosa and R. arrhizus, respectively, are also recommendable.
The protective effects of olive oil on the lipase stability against the denaturation or deactivation of protein in organic solvents were investigated. When lipases were incubated in organic solvents with olive oil, the lipases from C. rugosa in isooctane and from R. arrhizus in diisopropylether were substantially stabilized. The lipase stability increased in proportion with the concentration of olive oil in the organic solvents.
Characteristics of lipases from C. rugosa and R. arrhizus during the hydrolysis of olive oil in two phase system were investigated. Isooctane was used as an organic solvent for both lipases. An agitation speed at 800 rpm was fixed for sufficient reaction. The proportion of solvent phase and aqueous phase in the reaction mixture was set at the ratio of 8:2 for the study. The lipid hydrolysis rate of olive oil by lipases in two phase system increased in proportion with the olive oil concentration up to 90%(v/v), whereas in emulsion system the rate increased only up to 5% of oilve oil concentration and then decreased substantially thereafter with the increase of substrate concentration. The rate equation in lipid hydrolysis for various olive oil concentration deviated from the MichaelisMenten kinetics because the interfacial area was affected by the olive oil concentration in isooctane. The lipid hydrolysis rate for various pH of the aqueous phase(containing lipases) in two phase system was maximum at pH 6.0 and 6.5 for the lipase from C. rugosa and R. arrhizus, respectively. The optimum temperature for the raction was 35C and 40C for the Candida lipase and Rhizopus lipase, respectively. Other parameters such as hold up portion and agitation were also examined.
Lipases from C. rugosa and R. arrhizus were immobilized by entrapment with photo-crosslinkable resin prepolymer for the study of fat splitting and interesterification in isooctane-two phase system. Dioctysulfosuccinate was selected as the most suitable surfactant during the immobilization. Lipase entrapped with hydrophobic photo-crosslinkable resin prepolymer (ENTP-3000) exhibited the highest activity, whereas lipase entrapped with hydrophillic gel (ENT-4000) was more stable in organic solvent. As the degree of hydrophobicity of the immobilization matrix was increased, Vm(app) of the lipase entrapped was increased, but Km(app) was approximately constant. While the optimum pH of the lipases entrapped on hydrophillic gel (ENT-4000) were around pH 7.0, for Candida lipase and Rhizopus lipase, the reaction rate of the lipases entrapped on hydrophobic gel were less dependent to pH variations for short reaction time. However, for the longer reaction time, the lipases from C. rugosa and R. arrhizus entrapped on hydrophobic gel yielded maximum rate at pH 6.0 and 6.5, respectively. Entrapment method endowed the lipase with thermal stability and operational stability.
효소인 리파제를 이용하여 유지를 가수분해 시키거나 에스테르 교환을 위해서 이상계 (two phase system) 반응 시스템을 이용하였다. 사용된 효소는 미생물 균주에서 추출한 리파제로써 유지분해를 위해 Candida rugosa 에서 추출된 리파제이고 에스테르 교환을 위해서는 Rhizopus arrhizus 에서 추출된 리파제를 각각 사용하였다.
실험 내용은 리파제에 의해서 생성된 유리 지방산을 쉽게 정량할 수있는 방법을 먼저 개발하였고, 본 실험으로 들어가서 이상계에서 사용될 유기 용매중 가장 좋은 것을 선택하는 작업, 이상계 내에서 리파제의 특성, 그리고 리파제를 photocrosslinkable resin prepolymer 에 고정화시켜서 그의 특성을 연구하는 작업을 했다.
1) 유리 지방산을 정량하기 위해서, 간편하고 빠른 비색 방법을 개발했다. 이소옥탄을 추출 용매로 사용했기 때문에, 칼라를 띄게 한 다음 원심분리 작업이나 반응 용매를 증발시키는 작업이 필요 없으므로 많은 시간이 단축되어 1-2 분 안에 리파제의 활성도를 측정할 수 있었다.
2) 이상계 시스템을 이용한 리파제의 응용에 있어서 가장 적합한 유기용매는 두 리파제에 대해서 이소옥탄으로 나타났다. 그리고 시클로핵산과 디이소프로필에테르가 Candida 리파제와 Rhizopus 리파제에 각각 다음 으로 좋은 것으로 나타났다. 리파제의 기질로 사용된 올리브유는 이소옥탄이나 디이소프로필에테르 내에서 리파제의 안정도에 영향을 미치는데 올리브유의 농도가 높을수록 리파제의 안정도는 더욱 증가되었다.
3) 이상계 시스템에서는 에멀젼 시스템에서 일어나는 현상인 기질 저해성이 일어나지 않았는데, 그 결과 올리브유의 농도를 90% (v/v) 이상까지 높여도 리파제의 역가는 계속 꾸준하게 증가되었다. 2% (v/v) 올리브유를 사용한 이상계 반응에서는 25시간 내에 98% 가 유리 지방산으로 전환되었고 10%(v/v) 를 사용하였을 경우는 92% 이상이 48 시간 이내 유리 지방산으로 전환되었다. 이상계 내에서의 반응 속도 방정식은 Michaelis-Menten 속도 방정식을 따르지 않았는데 그 이유는 유기 용매내에서 기질의 농도가 변함에 따라 유기용매-올리브유로 구성된 상의 계면장력 (interfacial tension) 과 점성도 (viscosity) 가 변하기때문에, 기질의 농도에 따라 반응이 일어날 수 있는 계면면적 (interfacial area)이 변하기 때문이라고 결론 지을 수 있었다. 이상계 반응 시스템은 고체 지방에도 사용할 수 있thⓟ 가능성을 보여 주었다. 이상계 반응에서 각각의 Candida 와 Rhizopus 리파제에 대해 최적 pH는 6.0, 6.5 이었고 최적온도는 35℃ 와 40℃ 이었다. 4) 유기용매내 에서 리파제의 안정도를 높이기 위해서 photocrosslinkable resin prepolymer 에 고정화 시켰다. 그 결과 소수성 젤에 고정된 리파제가 역가가 높았으며 친수성 젤에 고정된 리파제는 역가가 낮았으나 안정도는 훨씬 증가하였다. 리파제를 고정화 시키면 열 안정도와 operational stability 를 크게 증가시켰다. 리파제를 고정화시키면 최적 pH 가 대체로 증가하였으며 활성화 에너지도 증가하였다. 소수성 젤에 고정된 리파제의 역가는 짧은 반응 시간에는 pH 에 크게 영향을받지 않았으나 장시간 반응시키면 역시 pH 에 영향을 받았다.
5) 올리브유를 가수분해 시키면서 얻은 Rhizopus 리파제의 유기용매 내에서 얻은 자료는 유지를 에스테르 교환 시키고자 할때 사용될 수 있다. 다만, 물리적 특성에만 제한된다.
