Utilization of liposome as a carrier of transporting genetic materials having relatively large molecular weight such as plasmids into yeast cells was tried in this investigation. Encapsulation of plasmids into liposomes may protect the DNA molecules from degredation. Membrane-membrane fusion may also facilitate transfer of plasmids when the liposomes are contact with yeast protoplasts.
Two types of yeast plasmids, YEp13 and pMA56, were entrapped separately into large unilamellar vesicle (LUV) or reversephase evaporation vesicle (REV) liposomes by the methods of ether injection or reversephase evaporation, respectively. Electron microscopic observations proved that the two types of liposomes prepared, LUV and REV, to be relatively homogeneous in size and structure having average diameter of 0.25 ㎛. The encapsulation of plasmids in the liposomes was evidenced by Sepharose CL-4B column chromatography using $^3H$-labeled plasmids. Encapsulation efficiencies of REV and LUV were about 50% and 6%, respectively. The plasmids entrapped in the liposomes could retain their original state of covalently closed circular form. And the original transformation activities of the entrapped plasmids were also found to be unaltered. These results were based on the experiments, such reisolation of plasmids from the liposomes, electrophoresis, and transformation.
The cells of Saccharomyces cerevisiae were converted to protoplasts by treating with Zymolyase 60,000. The enzyme concentration of 0.025 mg/ml was found to be suitable for yeast cells of $5×10^8$ per ml. The treatment was carried out under hypertonic conditions by adding 1.0M of sorbitol as osmotic stabilizer to protect protoplasts against osmolysis.
It was found that the hypertonic conditions provided to protect naked protoplasts reduced the rate of regeneration of the same protoplast substantively. The inhibitory effect could be avoided partially by growing the yeast cells under the same hypertonic conditions as for the protoplasting and regeneration. Such hypertonic preculture conditions did not affect on protoplasting, but increased regeneration rate at least two fold.
The protoplasts of S. cerevisiae prepared with hypertonically grown cells were subjected to contact with liposomes having YEp13 or pMA56 in them. The yield of transformation by REV liposomes was higher than the yield of transformation by conventional method of using naked plasmid DNA. Especially, when the transformation yield of entrapped plasmid DNA in liposome was calculated, the yield was at least four times higher than the yield of naked plasmid DNA.
It was confirmed from the present study that the entrapment of genetic materials in liposomes followed by subjecting to membrane-membrane fusion between the liposome and naked protoplasts of host cells may be used effectively for transformation of yeast cells specially when DNA fragments are not able to pass through the cytoplasmic membrane.
최근 수년 사이에 리포좀을 이용해서 여러가지 유전물질 들을 세포내로 전달하고자 하는 시도가 이루어졌다. 효모 Saccharomyces cerevisiae 는 대표적인 단세포성 진핵생물로서 유전자 재조합 원형질체 융합등 유전공학 연구의 대상 생물체로 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 큰 plasmid DNA를 효모 세포 속으로 전달하는 데에 리포좀을 운반체로 이용하고자 했다. 리포좀 내에 포획된 plasmid DNA는 외부의 DNA분해 효소로 부터 보호되어 지며 리포좀이 효모 원형질체와 접촉하면 세포막 융합 과정을 통하여 효모 세포내로 전달 되어질 수 있다.
효모 plasmid 인 YEp13 과 pMA56 각각을 에테르 주사법에 의해 거대 단일막 구조의 리포좀 (LUV) 과 reversephase evaporation 방법으로 REV리포좀에 포획시켰다. 생성된 이들 리포좀을 전자현미경으로 관찰하여서, 평균 지름이 0.25 ㎛ 이고 크기와 형체가 균일하게 생성됨을 알수 있었다. 방사성 동위원소인 삼중 수소로 표식된 plasmid 를 사용해서 리포좀을 만들고 세파로스 CL-4B 컬럼 크로마토 그라피를 실시한 결과, 이들 리포좀이 plasmid 를 포획하고 있음을 입증할수 있었으며, REV 리포좀은 처음 사용된 plasmid 의 50\%를 포획할수 있고, LUV 리포좀은 6% 정도의 포획율을 가진다는 사실을 알았다. 포획된 plasmid DNA 를 리포좀으로 부터 다시 분리해 내고 전기영동과 형질전환 실험을 함으로써, 이들 plasmid 가 포획되기 전과 같은 원래의 형태와 형질 전환 활성을 지닌 채로 포획되어 짐을 확인 했다.
리포좀이 효모 세포에 융합되기 위해 효모 세포를 원형질체로 변환시켜야 하는데, 이를 위해 Zymolyase 60,000 을 40분 동안 $5 × 10^8$ 세포에 0.025 mg/ml 농도로 처리해야 된다는 조건을 확립했다. 이때 삼투압 안정제로서 1.0M 의 sorbitol 을 첨가해 주어야 했다.
이렇게 해서 만든 원형질체는 리포좀을 융합시킬 수 있음을 형광 현미경을 이용하여 확인했다. 그러나 원형질체는 리포좀 융합 능력은 충분하나 원래의 완전한 효소 세포로 재생 되기가 어려웠다.
원형질체의 재생율 증진을 위해 삼투압 안정제의 효모 세포에 대한 영향을 조사해서, 삼투압 안정제에 의한 효모 세포의 성장 억제 현상을 관찰 했으며, 이런 현상은 삼투압 안정제가 포함된 고장액 배지에서 배양된 세포에서는 극복되어 짐을 알았다. 고장액 배지에서 배양한 세포로 부터 만들어진 원형질체는 osmolysis 방지를 위한 1.0M 의 sorbitol 이 첨가된 고장액 용액에서 보통의 원형질체 보다 훨씬 안정 하고, 재생율에 있어서 최소한 2배 이상 높았다. 고장액 배양에 의한 원형질체 재생율의 증진은 세포를 고장액 배지에서 배양함으로써 원형질체가 됐을 때 필요한 고장액 조건에 미리 적응할 수 있게 하였기 때문 이었다.
S. cerevisiae 를 고장액 배지에서 배양한 후 원형질체로 만들고 이 원형질체에 plasmid DNA를 포획하고 있는 리포좀을 접촉 시켜서 형질 전환체를 얻어낼 수 있었다. 처음 리포좀 제조시에 사용되었던 plasmid DNA 양에 대한 형질 변환체를 획득하는 효율은 그냥 plasmid DNA 를 사용한 통상적인 방법보다 REV 리포좀 에서 약간 높았다. 그러나 리포좀에 포획된 plasmid DNA양에 대한 형질 전환체 획득 효율로는 REV 과 LUV 리포좀 모두에서 통상적 방법보다 최소한 4배 이상의 높은 효율을 얻을 수 있었다.
이상과 같은 결과로 부터 효모 세포로 유전물질을 전달하는 데에 리포좀을 운반체로 사용할 수 있음을 알았고, 아울러 고장액 배양법에 의한 효모 원형질체의 재생율 증진은 일반적인 효모 원형질체를 통한 형질전환법 이나 원형질체 융합법에 적용해서 좀더 많은 형질전환체를 얻을 수 있음을 알았다.
