High cell density cultures of two model microorganisms were carried out in fed-batch system using pure oxygen. Major constraints in this type of culture were studied with Escherichia coli(facultative anaerobe) and Rhodotorula glutinis (obligate aerobe) as the model microbes.
In the high density culture of E. coli B, final concentration of the biomass was increased to 85-95 g/L. During the culture, gradual decreases of the biomass yield and the specific growth rate were observed, which seemed to be due to the build-up of by-products and high partial pressure of CO2. Accumulation of the by-products was not due to the limitation of oxygen, but due to the kinetic adaptation of E. coli. By-products exerted their negative effects on the specific growth rate and the biomass yield. Extent of by-products accumulation was affected significantly by operating conditions of the culture. It was possible to bypass accumulation of the by-products by restricting the 'relative' growth rate of E. coli. With increase of pCO2, the maximum specific growth rate was decreased. Continuous culture as a method of screening the inhibitory or stimulatory substances was critically discussed with the result of high pCO2 inhibition. It is, therefore, reasonable to say that in the high cell density culture of facultative anaerobe (E.coli) the major constraints are the accumulation of by-products and the high partial pressure of CO2.
In the high cell density culture of R. glutinis, no physiological constraints were observed; i.e. R. glutinis may be grown up to the point where volume of the bioreactor is physically occupied by the cells themselves. Final concentration of the biomass obtained was 185 g/L, and volume of cells at this concentration corresponded to about 70% of bioreactor volume. Lipid content was 40% of the dry biomass. R. glutinis could be also grown up to 110 g/L with air only because this microorganism grew without accumulation of by-products under the oxygen or nitrogen limiting condition.
Along with the high cell density culture of this yeast, kinetic and energetic aspects of the lipid accumulation in this yeast were studied using mass and energy balance(MEB) method. Intracellular accumulation of the lipid was controlled not only by limiting conditions for the specific nutrients but also by kinetic limit posed by the maximum specific rate of lipid synthesis. Decrease of biomass yield with accumulation of the lipid was observed and it was explained by applying MEB method in the analysis of oleaginous yeast growth. Particular characteristics of the oleaginous microbes includes; relatively low biomass yield on the carbon substrate, higher biomass yield on oxygen, and higher energetic yield. MEB theory was extended to the analysis of quantitative physiology in continuous culture.
생물공학 공정에서 생산성을 증가시키기 위하여 생물 반응기내의 미생물 농도를 증가시키는 연구를 행하였다. 절대 호기성균 으로는 미생물 유지 생산에 사용되는 Rhodotorula glutinis, 부분 호기성균 으로는 Escherichia coli B 를 각각 모델로 하여 순수 산소를 이용한 고농도 배양에서의 최대 균체농도를 결정하는 인자에 대하여 실험 하였다.
1) 부분 호기성 균인 E. coli B 의 고농도 배양에서는 최대 균체 농도 $90g/ℓ 를 얻을수 있었다. 초산등의 축적과 순수 산소를 이용하는 데서 오는 이산화탄소의 높은 부분 분압이 균체 농도를 더욱 증가시키는 데 있어서의 제한 요소인 것으로 밝혀졌다. 최대 산소 대사 속도의 제한으로 인하여 축적된 부산물은 최대 비 생장 속도와 균체 수율에 나쁜 영향을 미쳤다. 높은 이산화 탄소 부분압은 최대 비생장 속도를 낮추는 것으로 밝혀졌고, 부산물의 축적으로 촉진 시켰다.
2) 절대 호기성균인 R. glutinis 는 고농도 배양에서 $185 g/ℓ 의 균체 농도를 얻을 수 있었다. 미생물 생리학적 제한은 없었으며, 균체에 의해 생물 반응조가 완전히 채워질 때까지 배양할 수 있었다. 질소 제한을 하였을 경우 약 40%의 균체 지질을 얻을 수 있었다. 절대 호기성균인 R. glutinis는 산소 제한 상태에서 자신의 생장을 제한하는 부산물을 생산하지 않아서, 공기만을 사용했을 경우에도 $110 g/ℓ 의 균체 농도를 얻을 수 있었다.
3) 두 가지 균의 고농도 배양의 결과로 부터 순수 산소를 생물 공정에 사용할 수 있다는 것이 실증되었다. 높은 압력을 필요로 하는 공정에서는 용존 이산화탄소 농도의 증가가 문제시 될 것으로 보인다. 산업적으로 이용되는 많은 미생물의 경우 부산물 축적이 관찰되어 왔는데 부산물 축적에 영향을 끼치는 미생물 생리학적 요인에 대한 연구가 그런 균의 고농도 배양에서 중요할 것이다. 절대 호기성균의 고농도 배양에서는 적어도 미생물 생리학적 제한이 없으므로 절대호기성균의 사용이 유리하다고 생각된다.
4) 지질 생산균인 R. glutinis가 지질 축적 조건에서 균체 성장기보다 상대적으로 낮은 균체 수율을 보이는 것이 밝혀졌다. 유지 생산 단계에 대한 동력학적 분석과 MEB (mass and energy balance) 에 근거한 에너지적 분석으로 얻은 결과는 다음과 같다 :
· R. glutinis 에서의 지질 축적은 특정 기질에 대한 제한 조건 뿐만 아니라 동력학적 및 에너지적 제한을 받고 있다. 지질 축적단계에서 탄소원에 대한 균체 수율은 낮으며, 반면에 산소에 대한 균체 수율은 높았다.
·열역학적 균체 수율 (energetic yield, n)는 유지축적 균주와 유지 축적 조건에서 유지를 축적치 않는 균주에 비해 높았는데, 높은 열열역학적 균체 수율은 낮은 산소 요구량, 낮은 냉각 요구, 낮은 균체 유지 (maintenance) 에너지 요구 및 낮은 이산화탄소의 생산등과 이론적으로 관련시킬 수 있다.
·환경 변화에 대해 균체 조성이 많은 변화를 보일 경우에는, MEB 에 근거한 정량적 생리학 (quantitative physiology) 을 이용하여 성장 분석을 하여야 한다.
