Angiotensin I-converting enzyme (peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1) exhibits a unique chloride ion requirement for its full catalytic activity, but its requirement of chloride ion was not absolute.
The kinetic manifestation of chloride ion activation is characterized by a decrease in the apparent $K_m$ values for the substrates. The $V_{max}$ value is not much affected. The optimum pH was shifted gradually to the alkaline region up to pH 8.3 depending on the concentration of chloride ion. When the enzyme was saturated with chloride ion, the $K_m$ values decreased by a factor of 50, while only an 18% increase in $V_{max}$ was observed. The $K_{Cl}$ value for the enzyme-chloride binding was estimated to be about 150 mM in all cases regardless of the peptide substrates employed.
The effect of chloride ion on the molecular size of converting enzyme was studied by using several physicochemical techniques such as gel filtration, electrophoresis, and sucrose density gradient sedimentation analysis. As a result, it was found that there was no chance of the enzyme aggregation or dissociation by chloride ion, i.e. the mobilities of the enzyme in the exclusion chromatography, disc gel electrophoresis, and the sedimentation experiment were not much altered by the presence of chloride ion.
The purified hog lung converting enzyme was homogeneous in S.D.S. polyacylamide gel electrophoresis and in 5-20% w/v sucrose gradient sedimentation analysis. The enzyme contained no dissociable subunits under denatured conditions. The enzyme is found to be a single polypeptide chain, having a molecular weight approximately 150,000.
In the presence of chloride ion, the enzyme causes its spectral changes. The ultraviolet spectrum of converting enzyme showed a blue shift of 2 nm accompanied by a 7% increase in the intensity of the maximum absorption with 400 mM of NaCl.
Chloride ion also affected the fluorescence emission spectra of the converting enzyme. In the absence of chloride ion, $\lambda_{max}$ of emission was 342 nm, but in the presence of 400 mM NaCl, it was shifted to 346 nm resulting about 6% decrease in the relative intensity.
In addition, the pattern of chloride ion-dependence-$^A276$ increment is nearly parallel with the $Cl^-$-dependence-activation of converting enzyme. These results suggest that the chloride-activation of converting enzyme is due to the intramolecular conformational changes induced by chloride ion binding to the enzyme molecule.
To obtain more information on the chloride activation, we also examined the effects of denaturating agents, such as $\beta$-mercaptoethanol, 1,4-dithiothreitol, urea, and sodium dodecyl sulfate, on the catalytic activity, conformation, and structure of converting enzyme.
In conclusion, the mechanism of chloride activation is the results of specific binding of chloride ion to converting enzyme. We have established that chloride ion is, firstly, able to modify the microenvironment of some critical amino acid residues located at the active site of enzyme, and secondly, to induce the perturbation of aromatic residues as judged by spectrophotometric analysis. These factors may induce the activation of converting enzyme by increasing the affinity of the enzyme-substrate interaction.
Angiotensin I전환 효소는 특이하게 염소 이온에 의하여 효소의 활성이 증진된다. 염소 이온에 의한 이 효소의 활성화 현상은 1954년 말의 혈청에서 이 효소가 발견된 이래로 잘 알려진 사실이나 염소 이온에 의한 활성화 기전에 대한 연구는 거의 진행되지 않았다. 따라서 본 논문에서는 일련의 실험을 통하여 염소 이온이 이 효소의 분자 성질에 미치는 영향을 중점적으로 연구하였다.
염소 이온이 이 효소의 초기 속도에 미치는 속도 반응론적 연구를 통하여 염소 이온에 의한 이 효소의 활성화 기전은 염소 이온이 효소와 기질간의 친화력을 증진시켜주기 때문이라는 것을 알았다. 이 효소의 최대 속도는 염소 이온에 의하여 거의 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 염소 이온에 의한 이 효소의 활성화는 이 효소에 의한 가수 반응 기전에서 속도 반응론적인 활성화 기전이 아니라, 염소 이온이 효소의 분자 성질을 변화시켜서 효소와 기질간의 친화력이 증진되어 기질을 가수 분해시키기에 알맞은 구조가 됨으로써 효소의 활성화가 일어남을 시사해 준다. 따라서 이러한 속도 반응론적인 실험을 통하여 다음과 같은 두가지의 가설을 세울 수 있다. 첫째, 효소의 분자량 변화에 따른 활성화 기전, 둘째, 효소의 분자구조 변화에 의한 활성화 기전을 생각할 수 있다.
Gel filtration, 전기 영동 실험, 그리고 초원심 분리기와 같은 물리화학적 실험을 통하여 염소 이온에 의한 활성화는 이 효소의 분자량 변화에 의한 활성화 기전이 아님을 알 수 있었다. 이 효소는 하나의 polypeptide chain으로 이루어졌으며 분자량은 약 150,000 정도임을 전기 영동 실험과 초원심 분리기를 사용한 실험을 통하여 규명하였다.
염소 이온에 의한 이 효소의 구조 변화는 ultraviolet absorption 분석과 fluorescence emission분석을 통하여 증명하였다. 또한 염소 이온 농도 증가에 따른 276 nm 에서의 ultraviolet absorption 증가 양상은 염소 이온에 의한 효소의 활성 증가 양상과 거의 일치됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 염소 이온에 의하여 효소의 구조가 변화함을 시사해 주는 것이다. 염소 이온에 의한 효소의 구조 변화는 단백질 변성제가 이 효소의 활성과 구조에 미치는 영향을 염소 이온의 농도를 변화시킴으로써 조사한 실험에서 더욱 분명히 알 수 있었다.
결론적으로 염소 이온에 의한 Angiotensin I전환 효소의 활성화 기전은 염소 이온이 효소와 결합함으로써 효소의 구조 변화가 유발되어 기질에 대한 친화력이 증진되어지는 기전에 따른다고 추정 할 수 있다.
