Recently, a great number of deaths were caused by cancer that is a representative, incurable, and painful disease. Morbidity of cancer, which has been reported as one of high human mortality rate, is rising as human life expectancy increases. Late cancer diagnosis causes less survival rate and more painful therapeu-tics and life to the patients. According to cancer studies, an early diagnosis and early therapeutics are essential points for enhancing survival rate of cancer patients. To diagnose cancer disease in an earlier stage, a specific biomarker and a proper sensing probe should be utilized. Survivin mRNA, which is highly expressed in tumor cells, can be a potential biomarker for the diagnosis of cancer. To detect survivin, an efficient deliver method of the sensing probes into the cells should be developed.
In this regard, we developed a nanowire-incorporated microdevice for molecular beacon delivery into the tumor cells. The proposed microdevce consists of three layer: from top to bottom, a rectangular glass manifold, a monolithic thin polydimethylsiloxane (PDMS) membrane, and rectangular glass substrate with zinc oxide (ZnO) nanowire incorporated channel. Through the pneumatic microvalve function, the nanowires could directly penetrate the cellular membrane, and the probes coated on the nanowires could be delivered.
Molecular beacon (MB), a dual-labeled single nucleotide strand with a fluorophore and a quencher, was employed as sensing probe and targeted survivin mRNA of human breast cancer MCF-7 cells. Fluores-cence signal of the MB was used as delivery evidence and ZnO nanowires were functionalized with MBs by disulfide conjugation chemistry using 3-(2-Pyridyldithio)propanoic acid (PDPA) moieties. Once the cells were loaded in the microchannel, pneumatic pressure was applied to induce the penetration of cells with nan-owires. During incubation, disulfide bonds of the functionalized nanowires were cleaved due to highly reduc-tive environments of cytosol, releasing the MBs. The released MBs were finally hybridized with the target survivin mRNA, which exists in the cytosol of cells. Green fluorescence of the resultant MB-survivin mRNA duplex could be observed with a confocal microscope due to spatial separation of a fluorophore and a quencher. To enhance the cell viability and to optimize the delivery efficiency, the supplied pressure was con-trolled. Docetaxel, which can up-regulate the expression of survivin, was treated on cells, and accordingly the enhanced green fluorescence signal was observed in the cells in proportional to the concentrations of docet-axel. These results indicate that the nanowire-incorporated microdevice could quantitatively perform the probe delivery into the cells with high efficiency and viability.
암은 높은 사망률을 차지하고 있는, 대표적인 불치병이다. 알려진 대로, 암환자의 생존율에 있어 조기 진단은 매우 중요한 요소이다. 늦은 진단과 치료는 환자의 생존율을 크게 낮출 뿐 아니라 고통스러운 치료를 야기한다. 조기 진단을 위해, 종양 세포 혹은 암세포 내에 존재하는 적절한 biomarker와 이를 감지할 수 있는 probe의 활용은 필수적이다. Survivin mRNA는 종양 세포 내에서 높은 발현율을 보이는 mRNA로, 암 진단에 있어 효과적인 biomarker로 활용할 수 있으며, 세포 기질 내에 존재한다. Survivin을 감지하기 위해, probe의 효과적인 세포 내 전달 방법의 개발이 필요하다.
이로부터, 암세포 내 분자 비콘 전달을 위한, 나노와이어가 집적화된 마이크로 칩을 개발하였다. 본 연구에서 사용된 마이크로 칩은 위에서부터, 상단부 manifold, 중단부 PDMS mem-brane, 그리고 나노와이어가 패터닝된 마이크로채널이 있는 하단부의 3층 구조로 제작되었다. 공압 구동 마이크로펌프의 기능을 통해, 나노와이어는 세포들을 직접적으로 관통하여 분자 비콘의 직접 전달을 가능케 한다. 분자 비콘은 단일 가닥 oligonucleotide의 이차원 구조체로, 특정 염기 서열을 가진 DNA를 감지하는 데 널리 이용되는 물질이다. 한편, 나노와이어는 MEMS 기술과 융합되어 전자공학, 기계공학, 생명공학, 화학공학 등 여러 분야에서 다양하게 응용되고 있는 나노구조체로서, 합성 및 크기의 조절이 용이하며, 여러 재료 표면에 합성하여 사용 가능한 장점을 가지고 있다.
나노와이어를 활용하여 물질을 전달하는 연구에 있어, 나노와이어 표면에 목표 물질을 고정하고 주입하는 기술이 필수적이다. 본 연구에서는 이황화 결합을 통해 성공적으로 나노와이어 표면에 분자 비콘을 고정화시킬 수 있었다. 세포가 마이크로채널 내에 주입된 후에 마이크로펌프를 구동시키면 칩 상단부의 manifold를 통해 압력이 가해지게 되고, 이에 따라 PDMS membrane은 마이크로채널 내 세포들에게 압력을 가한다. 이에 따라, 마이크로채널 바닥에 패터닝된 나노와이어는 세포를 관통한다. 세포 내부의 환원 특성으로 인해 적정 시간 이후에 이황화 결합은 소멸되며, 분자 비콘은 나노와이어 표면을 벗어난다. 세포 내 주입된 분자 비콘은 목표 물질인 sur-vivin mRNA를 만나 결합하여 이중 나선 구조를 이루게 되고, 이로부터 형광 신호를 관찰하였다. 또한 공압 구동 마이크로펌프의 압력 조절을 통하여 나노와이어의 세포 관통 정도를 조절하였으며, cell viability test를 통해 적절한 압력 조건을 설정하였다. 마지막으로 survivin의 발현을 돕는 약물인 docetaxel의 농도별 처리를 통해 농도에 따라 증가된 형광 강도를 관찰할 수 있었으며, 이를 통해 샘플 간 상대적 survivin의 발현 정도를 수치화시킬 수 있었다.
나노와이어 표면에는 분자 비콘 뿐 아니라 유전자, 약물 등 여러 전달 물질을 고정화시킬 수 있다. 본 연구에서 개발한 칩은 적절한 목표 물질과 전달 물질의 설정을 통해 그 활용 범위를 더 넓힐 수 있을 것으로 기대된다.
