Multicellular spheroid, which is an aggregated form of cells in a spherical shape, provides a relevant pathophysiological gradients of various chemicals that reflects the environment of tumors, since the 3D structure acts as a barrier against chemical diffusion. Also, the extracellular matrix (ECM) surrounding the spheroid and the anchorage-independent growth of solid tumors based on strong cell-cell interactions well represents the nature of tumors that conventional culture system cannot reproduce, suggesting matrix-based spheroid culture system’s possibility as an in-vitro model for studies of tumors.
Among various tumors, glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most malignant brain tumor, which has poor prognosis and high recurrence rate. Based on previous reports, glioblastoma cancer stem cells (GSCs), which take a minor subpopulation within the tumor mass, are rising as a therapeutic target for GBM studies due to their high tumorigenic potential and resistance to current therapies. Since the formation of neuro-spheres is one of the characteristic abilities of GSCs, sphere culture is a common strategy for culturing GSCs.
In this study, we developed hydrogel based 3D platforms for GSC spheroid culture, which provides 3D polymeric networks. First, we improved the limited porous architecture of poly(ethylene)glycol (PEG)-based hydrogel by incorporating additional hydrogel network. We were able to observe encapsulated single GSCs successfully form spheroid in the matrix, while it failed to form spheroid in the unmodified PEG-based hydrogel. Since GSC spheroids forms dominantly by growth of single GSCs and resulted in a multi-dispersed manner, we believe our platform could be utilized as a drug screening platform for spheroid-type cells. Next, we developed collagen type I hydrogel-based GSC spheroids culture platform for study the invasion of GBM. Through the adhesion between collagen matrix and GSCs, encapsulated GSC spheroids invaded into the surrounding matrix and exhibited elongated morphology. Based on this simple invasion model, we designed a co-culture platform by incubating glioma stromal cells in the surrounding collagen matrix, in order to find their effects on GSC spheroids invasion. We observed that glioma stromal cells accelerates the invasion of GSC spheroid via ‘cross-talk’ between two types of cells. We believe that our results suggests the new therapeutic approach for treating GBM, and also our platform could provide a powerful tool in testing anti-migratory drugs for GBM.
In conclusion, we engineered PEG-based hydrogel to culture GSC spheroids by providing the enough void space in inner structure. Also, GSC spheroids were cultured in collagen-based hydrogel to study the invasion of GSC spheroid and to investigate the role of micro-environmental factors. Thus, we expect that our hydrogel-based platforms, which better recapitulate the native in-vivo tumor environment compared to conventional culture systems, could contribute to study of GBM.
다세포 스페로이드 (multicellular spheroid)는 세포들이 구형태로 삼차원적인 집합체를 이루고 있는 것으로, 고형암 (solid tumor)과 유사한 구조를 가지고 있을 뿐 아니라 기존의 단층 배양법 (monolayer culture)에 비하여 생체 내 암 조직의 생리적 상태를 모사할 수 있다. 대표적으로 100 - 200 μm 크기를 가진 스페로이드는 물질 전달의 제약에 의하여 그 내부에서 물질의 농도 기울기가 형성되며, 따라서 무혈관 (avascular)상태의 삼차원 암 조직 모델로서 이용된다. 이러한 스페로이드 배양 시스템은 일반적으로 부유배양 (suspension culture)을 통해 이루어지고 있다. 그러나 세포들은 세포 주위의 미세환경과 긴밀하게 상호작용을 하기 때문에 삼차원 미세환경을 구현한 스페로이드 배양 시스템의 필요성이 대두되고 있다. 특히 세포외기질 (extracellular matrix)은 미세환경을 이루는 중요한 인자로서, 생화학적 기능과 물리적 기능을 가진다. 또한, 악성 교모세포종 (Glioblastoma multiforme)은 가장 치명적인 뇌종양으로 그 예후가 매우 좋지 않다. 현재 교모세포종 치료를 위해 수술적 절제, 방사선 치료와 화학요법이 병행적으로 이루어지고 있으나 뇌교종세포의 높은 침윤성과 치료에 대한 저항성을 보이는 뇌종양 줄기세포 (glioblastoma cancer stem cell)등으로 인하여 완벽한 치료가 불가능하며 이에 따라 새로운 치료법의 개발이 꼭 필요하다. 따라서 본 연구에서는 교모세포종 연구를 위해 세포외기질과 비슷한 성질을 가지는 수화젤을 이용하여 미세환경을 모사한 교모세포종 스페로이드의 삼차원 배양 플랫폼을 개발하고자 한다.
먼저, PEG 기반의 수화젤은 생물학적 활성이 없기 때문에 세포에는 아무런 영향을 주지 않은 채 미세 구조만 제공할 수 있다는 장점을 가지지만, 메쉬 크기 (mesh size)가 나노 스케일로 작기 때문에 내부에 캡슐화 (encapsulation)된 세포의 생물학적 행동들을 제약한다. 반면, alginate가 포함된 PEGDA-ALG 수화젤은 기공 크기 (pore size)와 다공성 (porosity)이 PEGDA 수화젤에 비하여 증가됨을 보였다. 제작된 PEGDA-ALG 수화젤을 탈수 (dehydration)하고, 뇌종양 줄기세포를 시딩하였을 때 높은 밀도로 세포들이 침투되는 것을 확인하였다. 또한, 뇌종양 줄기세포들이 침투된 PEGDA-ALG 수화젤을 약 2주간 배양하였을 때, 세포들이 증식과 자가조립을 통하여 약 100 μm 크기의 스페로이드로 성장하는 것을 볼 수 있었다. 반면, 작은 기공 사이즈와 낮은 다공성을 가지는 PEGDA 수화젤 내에서는 스페로이드가 잘 형성되지 않았으며, 이로부터 수화젤 기반 지지체내에 빈 공간이 충분히 제공되었을 때, 뇌종양 줄기세포 스페로이드의 형성이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 따라서 충분한 다공성을 가지는 PEGDA-ALG 수화젤은 증식과 자가조립을 통해 뇌종양 줄기세포 스페로이드의 형성을 가능하게 하였으며, 기존의 부유 배양법에 비하여 세포 내 미세환경을 잘 구현함에 따라 스페로이드 타입의 세포에 대한 약물 스크리닝 모델로 사용이 가능할 것으로 기대한다.
다음으로, 콜라겐은 세포외기질에서 가장 풍부한 요소로서 세포가 콜라겐에 부착할 수 있는 수용체 (integrin)을 가지고 있음에 따라 세포와 상호작용을 일으킨다. 따라서 콜라겐 수화젤 내에 스페로이드를 캡슐화 시킴으로써 생체 내에서 교모세포종 종양의 행동을 모사 하였다. 결과적으로 콜라겐 수화젤에 캡슐화된 뇌종양 줄기세포 스페로이드는 스페로이드와 기질의 경계면에서 단일 세포들이 수화젤 안으로 침윤하는 것을 확인하였으며, 이 때 세포의 형태가 매우 신장되었다. 또한, 최근 교모세포종의 예후에 영향을 주는 것으로 보고된 뇌종양 기질 세포 (glioblastoma stromal cell)를 뇌종양 줄기세포 스페로이드와 콜라겐 수화젤 내에서 공배양 (co-culture)함으로써 이 뇌종양 기질 세포가 뇌종양 줄기세포 스페로이드의 침윤성을 현저히 증가 시킨다는 것을 확인하였다. 마지막으로, 콜라겐 수화젤 기반 뇌종양 줄기세포 스페로이드 배양 플랫폼에 침윤성을 억제하는 잠재적 표적 약물 (potential anti-migratory drugs)들을 처리하여, 스페로이드의 반응성을 확인하였고 실제 삼차원 약물 테스트 플랫폼으로의 사용을 보였다.
이러한 결과로부터, 수화젤을 기반으로 한 다세포 종양 스페로이드의 삼차원 배양 시스템은, 실제 교모세포종 조직의 미세환경과 뇌종양 줄기세포의 성장과 침윤성을 모사할 수 있어, 이를 토대로 표적 약물의 반응성에 대한 대용량 검사 (high throughput screening)를 포함한 교모세포종의 연구에 유용한 삼차원 모델로 사용이 가능할 것으로 기대한다.
