For the production of lipids by microbial means as an alternative or unique lipid source other than the conventional plant and animal sources, fundamental studies on such cellular physiology as growth, lipid production and biochemistry of lipid accumulation in oleaginous yeast have been undertaken.
$\underline{Rhodotorula gracilis} (syn. \underline{Rh. glutinis}$) NRRL Y-1091, a red oleaginous yeast, has been grown under favorable and less favorable-lipogenic conditions using batch and continuous culture systems. At first, to select most suitable carbon and nitrogen sources for the efficient lipid production, the yeast cells were grown on various carbon and nitrogen sources. Among the sources examined, glucose and ammonium sulfate were found to be most suitable.
Both good growth and lipid production have also been observed when yeast cells are grown on cellulase hydrolyzate of alkali-treated rice straw.
The quantitative physiology of the organism has been studied by use of a continuous culture system. Specific uptake rates of the key nutrients have been measured at various dilution rates, i.e., various specific growth rates, and from these results the cellular growth, yield coefficients and maintenance coefficients for each nutrient are obtained. From the fermentation data, the volumetric lipid productivity and specific lipid production rate also have been estimated.
The lipids obtained from batch and continuous cultures are characterized in detail. The proportions of lipid classes in intracellular lipids have been changed as dilution rate altered. The amounts of components in each lipid class were also varied depending upon the cultural conditions. The effects of cultural conditions on fatty acid composition and degree of unsaturation have been observed.
From the data of nutrient consumption, growth yield coefficient and lipid analysis, the conversion efficiency of glucose to storage lipid has been estimated.
The catabolic pattern of glucose in oleaginous yeast is known to be different from that of non-oleaginous one. The proportions of glucose being metabolized either via pentose phosphate pathway or glycolysis have been determined at various dilution rate. As specific lipid production rate increased, the proportional contribution of pentose phosphate pathway in glucose catabolism was increased. The reducing equivalents prerequisite to lipid biosynthesis have been found to be origniated mostly from pentose phosphate pathway, not from malate enzyme action.
From the studies on enzymes related to glucose catabolism and lipogenesis, it is found that pyruvate kinase and ATP: citrate lyase are interrelated with the control mechanism of lipid biosynthesis.
The effect of nutrient limitation and dilution rate on intra-and extracellular adenine nucleotides concentration have been studied and the intracellular energy charges in nitrogen-limitation were higher than those in carbon-limitation. With the results of glucose metabolism, enzyme studies and energy levels in cells, the lipids accumulation mechanism has been proposed.
미생물 유지를 생산하기 위하여, 우수한 유지 생산 균주의 하나인 $\underline{Rhodotorula gracilis} (syn. \underline{Rh. glutinis}$) NRRL Y-1091 을 이용하여 회분식 및 연속식 배양 실험을 행하였다. 효율적인 탄소원 및 질소원을 찾기 위하여 회분식 실험을 한 결과 포도당과 ammonium sulfate가 가장 좋은 결과를 보였다. 알칼리 전처리한 볏짚을 cellulase 로 가수분해 시킨 hydrolyzate를 탄소원으로 사용하였을 때도, 활발한 세포증식 및 유지 생산이 관찰 되었으며, 5 탄당인 xylose 배지에서도 좋은 성장을 나타내었다. 이러한 결과는 값이 싼 탄소원을 이용하여 미생물 유지 생산이 가능함을 시사해 주는 것이다. 회분식 및 연속식 배양실험 결과, 유지는 질소원 제한 조건하의 낮은 희석율 에서 다량 생산 되었는데, 이때의 지방수율 (fat coefficient) 은 16.4g/100g glucose로 제일 높았다. 질소원 제한 조건하 에서는 희석율이 증가할수록, 생체량 및 지방 함량은 감소하였다. 탄소원 제한 조건하 에서는 희석율이 증가 할수록 생체량은 감소하였으나, 지방 함량은 11-15% 로 거의 일정한 수준으로 유지 하였다. 전체 지방중 저장성 유지의 함량은 약 80% 가량이었고 이중 트리-글리세리드는 약 85% 가량 포함되어 있었다.
중성 지질의 대부분은 트리-글리세리드였으며, 토코페롤은 함유되어 있지 않았다. 포도당에서 저장성 유지로의 전환 효율은 구조성 및 기능성 지질로의 전환 효율보다 높았다. 중성지질, 인지질 및 당지질을 구성하고 있는 주요 지방산은 팔미트산, 올레산 과 리놀레산 이었다. 희석율이 증가하면 할수록 리놀레산, 리놀렌산 과 같은 다중 불포화 지방산의 함량은 증가하였고, 팔미트산 과올레산 같은 포화 지방산과 단일 불포화 지방산의 함량은 감소하였다. 그러므로 질소원 및 탄소원 제한 조건 모두 희석율이 증가할수록 지방산의 불포화도는 현저히 증가 하였다. 질소원은 미생물의 유지 에너지원 에는 이용되지 아니 하였으며, 탄소원 제한 조건하에서의 비 산소 흡수율은 질소원 제한 조건하의 그것보다 높게 나타났다.
본 균주의 포도당 대사는 pentose phosphate pathway 및 glycolysis의 두 경로를 통하여 이루어짐이 판명되었고, pentose phosphate pathway가 전체 대사중 차지하는 비율은 비 유지 생산율이 증가할수록 현저히 증가하는 것으로 나타났다. 이 현상은 $^{14}CO_2$ ratio $(^{14}CO_2$ evolved from $[1-^{14}C]$ glucose/$^{14}CO_2$ evolved from $[6-^{14}C]$ glucose) 의 증가로도 규명 되었다. 유지 생합성에 필요한 환원력은 대부분 pentose phosphate pathway 에 의하여 공급되는 것으로 나타났으며 malate enzyme 은 환원력 공급에는 중요한 역할을 하지 않는 것으로 나타났다.
Pyruvate kinase 와 ATP:citrate lyase 의 비 역가는 비유지 생산율과 직선적인 관계를 가지고 변화하는 것으로 미루어 이들 두 효소는 미생물 유지 생합성 경로내의 조절 기작에 관여하고 있는 것으로 나타났다. 질소원 제한 조건하에서의 세포내 adenine nucleotide 의 농도는 탄소원 제한 조건하의 그것보다 높게 나타났으며, 세포내 energy charge 도 역시 같은 경향을 보였다.
