L-Malic acid was added to the culture medium and its effects on growth and metabolism of Leuconostoc oenos strains ML34 and A25 were observed. The level of pH in the culture solution during batch cultures was not controlled while it was maintained constant in continuous cultures. For the continuous cultures the amount of glucose in the culture medium was regulated to limit the growth. Samplings from the continuous cultures were made when each culture reached steady state.
The batch culture results showed distinct stimulation of L-malic acid on the specific growth rates of both strains at all levels of initial pH's with optimum around 4.5. The change of medium pH during the culture due to the malo-lactic fermentation did not correlate with the growth stimulation. It was also shown that L-malic acid did not serve as energy source in this case. Studies, therefore, were directed to explore mechanisms involved in the growth stimulation of L-malic acid.
Carbon dioxide liberated from the malolactic fermentation was found to be partially responsible to the stimulation of growth of L. oenos cells by L-malic acid. The presence of L-malic acid in culture medium increased substrate affinity and reduced maintenance energy in these organisms substantially. These roles of L-malic acid could help to explain the growth stimulation of the compound. In addition to these mechanisms, the growth of L. oenos strains seems to be strongly accelerated by the rapid utilization of glucose stimulated by L-malic acid. The following evidence obtained from the present study explains L-malic acid stimulation on glucose utilization of the organisms.
When 15 mM of L-malic acid was added to the culture medium having excess glucose, the synthesis of D-lactic dehydrogenase (D-LDH) in ML34 increased 5.5 fold and 2.3 fold in A25. L-malic acid stimulated the activity of D-LDH also ; the presence of L-malic acid in the reaction mixture almost doubled the enzyme reaction in both strains. It was also observed that the pH level of culture medium affected strongly on both growth and D-LDH synthesis with the same optimum range. In other words, the malate stimulation effects on growth rate and on D-LDH synthesis appear to be correlated.
The heterolactic bacteria L. oenos strains ferment glucose yielding three major endproducts, D-lactate, acetate, and ethanol with evolution of carbon dioxide. D-LDH participates in the last step of D-lactate formation. The continuous culture data showed that when D-LDH level in the cell increases the cell grows faster. Furthermore, when the intracelluar D-LDH level increased, two endproducts, D-lactate and ethanol, increased leaving the third endproduct, acetate decreased. Interestingly enough, the balance between D-lactate and ethanol remained constant at the rate approximately 4 to 3 throughout the dilution rates tested. In other words, the higher D-LDH level caused by the presence of L-malic acid increased the efficiency of glucose utilization resulting in the faster growth of L. oenos strains.
미생물 배지에 첨가된 L-malic acid 가 Leuconostoc oenos ML34 와 A25 의 증식 및 대사에 미치는 영향을 연구하였다. 회분 배양 에서는 pH 를 조절하지 않았으며 연속 배양 에서는 pH 를 일정하게 유지하였다. 연속 배양 실험 에서는 glucose 를 증식 제한 기질로 사용 하였고 steady state 에 도달 하였을때 시료를 채취하여 분석에 사용 하였다.
회분 배양 에서 L-malic acid 는 증식 최적 pH 를 포함한 모든 초기 pH 에서 뚜렸한 증식율 촉진 효과를 보였다. 그러나 L-malic acid 발효에 수반하여 생긴 배지의 pH 변화와 L-malic acid 에 의한 증식촉진 현상과는 일치된 관련성을 보여주지 않았다. 또한 L-malic acid는 균체 증식의 에너지원으로 사용되지 않음을 보였다. 따라서 L-malic acid 의 증식에 관한 기작을 체계적으로 연구 하였다.
Malo-lactic발효과정 에서 생성되는 이산화탄소가 부분적으로 L-malic acid 에 의한 균체 증식 촉진작용에 관련됨이 관찰되었다. 배지에 첨가된 L-malic acid는 L. oenos 의 glucose 에 대한 친화성과 ATP 에 대한 증식 효율 ($Y_ATP$) 을 현저하게 증가시켜 주었다. 이것은 L-malic acid 존재하 에서 maintenance energy 의 소요량이 크게 감소한 결과로 추정되었다.L-malic acid 의 이와같은 역할은 그것에 의한 균체증식 촉진 현상을 설명 하는데 도움이 될수 있었다. 그외 L. oenos의 증식은 L-malic acid 에 의한 증가된 glucose 이용에 의해 촉진되는 것 같았다.
본 연구에서 얻은 다음의 결과는 L-malic acid 가 균체의 glucose 이용을 높여 준다는 사실을 뒷받칟 해주고 있었다. L-lalic acid 가 15 mM 농도로 glucose 비제한 배지에 첨가 되었을때 해당과정의 중요한 효소인 glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase 및 phosphoketolase 의 역가에는 큰 변화가 없었으나 D-kactate dehydrogenase (D-LDH) 의 생합성은 ML34 에서 5.5배 그리고 A25 에서 2.3 배 증가 하였다. 또한 L-malic acid는 D-LDH 의 역가를 거의 배로 증가시켰다. 배지의 pH 는 균체의 증식과 D-LDH 의 생합성에 크게 영향을 미치고 있었으며 양자의 최적 pH 는 일치하였다. 따라서 L-malic acid 에 의한 균체증식율 및 D-LDH 생합성 촉진 효과는 상관관계가 있음이 보였다.
L. oenos 는 heterofermentation 을 하여 glucose 로 부터 D-lactate, acetate, ethanol 및 이산화탄소를 생성하였다. D-LDH 는 D-lactate 생성의 최종 단계에 관여하고 있다. 연속 배양 결과는 균체의 증식속도가 빠를때 균체내의 D-LDH 수준이 높음을 보였다. 균체내의 D-LDH 수준이 높아졌을때 D-lactate 및 ethanol 의 생성은 증가 하였으나 acetate 의 생성은 감소하였다. 그리고 0.022 - 0.046 희석율 범위내 에서 D-lactate 와 ethanol 의 balance 는 약 4대3의 비율로 일정하게 유지되었다. 따라서 L-malic 의 존재하에서 관찰된 높은 균체증식 현상은 L-malic acid 에 의한 증가된 D-LDH 수준이 glucose 이용 효율을 높여준 때문인 것으로 보였다.
