Overexpression of biologicall active lymphotoxin, i.e. tumor necrosis factor-$\beta$, was attempted using genetic engineering strates.
The lympnotoxin gene contained in pLTl was transfered is pASI and constructed a new plasmid pALI. The signal sequence of precursor lymphotoxin gene in pALI was removed. With this pALIII, Escherichia coli M5248 was transformed and production of lymphotoxin was attempted. However, the E. coli transformant having pALIII did not produce lymphotoxin. The $P_L$ promoter of the lymphotoxin gene in pALIII was replaced with trc promoter and constructed prtcLT which produced lymphotoxin below 1% of total cell proteins in E. coli.
To increase the lymphotoxin production, the cDNA sequence of lymphotoxin gene was mutated by altering the translation initiation region using chemically synthesized oligonucleotides avoiding the local secondary structure of mRNA. The mutations were so designed to maintain the original amino acid sequence of lymphotoxin unchanged. The structures of mRNA of lymphotoxin were predicted in the translation initiation region based on the shorth range interaction of mRNA spanning 5' terminal 130 nucleotides. The expressions of lymphotoxin were increased as the predicted local secondary structure of mRNA decreased. The elevation of cultivation temperature also increased the expression level of lymphotoxin. The amounts of mRNA were not significantly different when the cultivation temperature decreased to 32$^\circ$C or increased to $42^\circ$C. The maximal yield of expression level of lymphotoxin was 12% of total cell proteins. Most of produced lymphotoxin in this system were biologically active form.
Another trial of overproduction was performed by expressing the cDNA sequence of human lymphotoxin gene in T7 expression system. A production of lymphotoxin at the level of 16% of total cell proteins was observed, but the production was in the form of insoluble insoltions body. The modifications by the criteria descrived in above section were resulted in the enhancement of the expression level of lymphotoxin. The expressed lymphotoxin was 46% of total cell proteins. Almost all lymphotoxin produced by these modifications were insoluble aggregate.
The insoluble aggregate of lymphotoxin produced by the T7 expression system was denatured and refolded to biologically active form. The insoluble aggregates of lymphotoxin were dissolved with the denaturating agents such as urea, guanidine hydrochloride, and 01. M sodium hydroxide. Solubilized aggregate of lymphotoxin by urea or guanidine hydrochloride has not been refolded to a soluble form in the physiological condition. Refolding as a biologically active form was successful only when the insoluble aggregate was dissolved in the extreme alkaline condition then rapidly neutralized by adding the hydrogen chloride. About 6% of total proteins was refolded to biologically active protein. The specific activity in this case was $3-4 ×10^5$ units/mg.
I. 생리활성 종양괴사인자의 생산
대장균에서 사람 종양괴사인자를 대량생산하기 위하여 trc promoter 를 사용하였다. 종양괴사인자의 cDNA를 이용하였을 때 발현율이 매우 저조하였다. 배양 온도를 32 ℃, 37 ℃, 그리고 42℃로 하였을 때 종양괴사인자의 발현율이 증가 하였다. 이러한 발현율의 증가는 mRNA양의 증가에 의한 것이 아니었다. 종양괴사인자의 mRNA 이차구조를 추론한 바에 의하면 translation 개시 코돈인 AUG가 안정한 이차구조 내부에 포함되어 있는 것으로 생각 되었다. 이러한 발현율의 저조는 mRNA의 이차구조 성질에서 기인 한다고 볼 수 있다. 종양괴사인자의 유전자를 변형시켜 mRNA의 이차구조를 강화시켰을 때 종양괴사인자의 발현율이 저하되는 것을 알 수 있었다. 이러한 mRNA의 이차구조 추론과 종양괴사인자 발현율의 상관 관계를 이용하여 종양괴사인자 유전자를 변형시켜 대량 발현을 시켰다. 유전자의 변형에 의한 종양괴사인자의 아미노산 서열은 원래의 종양괴사인자와 동일하게 하였다. 이러한 변형에 의해서 종양괴사인자의 발현율은 전체 단백질의 12%로 향상되었다. mRNA의 이차구조 추론에 있어서 translation 개시 부분을 포함한 5` 말단 130 nucleotides가 적절하였으며 더많은 nucleotides를 포함시킨 경우에는 이차구조 추론과 발현율은 유의성이 없었다.
배양온도를 42 ℃까지 증가 시켰을 때 전체 종양괴사인자의 발현율은 증가하였으나 생물학적 활성이 있는 종양괴사인자의 발현율은 37 ℃가 가장 높았다.
II. 비활성 종양괴사인자의 발현과 그의 활성화
T7 발현 체계를 이용하여 종양괴사인자를 발현시켰다. 발현된 종양괴사인자는 비활성의 단백질 덩어리로서 전체 단백질의 16%였다. 위 절에서 사용한 원리에 의해 종양괴사인자 유전자의 mRNA의 이차구조 형성을 감소시킨 결과 종양괴사인자의 발현율을 46%까지 증가시켰다.
이와같이 생산된 불용성의 종양괴사인자를 생물학적 활성이 있는 단백질로 전환시키기 위해 여러가지 시도를 하였다. 세포에서 분리한 단백질 덩어리를 수산 용액으로 녹인 다음 염산 용액으로 중화시킨 결과 생물학적 활성이 있는 종양괴사인자를 얻을 수 있었다. 이러한 방법에 의해서 불용성의 종양괴사인자의 6% 정도가 수용성으로 전환되었다. 전환된 종양괴사인자의 활성은 $3-4\times10^5$ units/mg 이었다.
