The structures of two peptide hormones, glucagon and luteinizing hormone releasing hormone, and functional and non-functional signal peptides of Escherichia coli ribose binding protein have been elucidated by detailed NMR and CD. The results are summarized below.
(1) The structure of monomeric glucagon in dilute aqueous solution was studied by 500 MHz NMR. Hydrogen-deuterium exchange experiments monitored by NMR showed that the backbone amide NHs form intrastrand hydrogen bonds suggesting the existence of some degree of compact structure. The temperature dependent shift of several amide NH resonances supported the above conclusion. The small J coupling constants arising from the interactions between 6 amide NHs and C$\alpha$Hs(less than 6 Hz) implied a helical structure.
(2) The NMR and CD studies on the structure of LHRH in water/TFE solution were performed at pH 3 and pH 7. At pH 3, no discernible structure was seen by CD measurement in the temperatures of 10℃ and 25℃. But the evidences of the existence of a turn was obtained by NMR measurement at 10℃. At pH 5, and in more higher pH, the preference of $\beta$-structure was found. The effect of pH on the LHRH structure was discussed. In addition of $\beta$-structure, we could find out the characteristic NOEs of $\beta$-turn at pH 7. It seems that the antiparallel $\beta$-structure accompanying $\beta$-turn on the middle of sequence is unstable at low pH due to the ionization of His-2 residue. We suggest that the main structures of LHRH are $\beta$-turn and $\beta$-structure in water/TFE solution and there is an unusual turn rather than the random structure at low pH, water/TFE(1:1 by volume) solution.
(3) The structures of chemically synthesized functional and non-functional signal peptides of Escherichia coli ribose binding protein were compared in the solvents which mimic the amphiphilic environments by CD and 2D 1H NMR. The functional peptide have a helix consisted of 19 residues starting from N-terminal to the hydrophobic core in 10% dimethylsulfoxide (DMSO), 40% water and 50% trifluoroethanol (TFE) (by volume). The non-functional peptide have no helical structure in that solution but have an $\alpha$-helix of 11 residues within the hydrophobic core with in water/TFE (50%, by volume) solution. It appeared that the Pro-9 residue in the non-functional peptide disturbs the helix propagation to the N-terminal region. Because both peptide have a stable helix on hydrophobic core in the solvent which mimics the amphiphilic environment, we conclude that 2 turns of $\alpha$-helix in N-terminal is important for the function of the signal peptide. Comparing the results from LamB signal sequence (1) which showed that the helix of functional peptide is extended to C-terminal region, we suggest that the critical requisite for function of signal sequence is the dimension rather than the site of helix on the sequence.
두가지 펩티드 호르몬(글루카곤,LHRH)과 대장균 리보스 결합단백질내 신호서열의 구조연구가 NMR과 CD에 의해 수행되었다. 세가지 주제에 대한 요약은 다음과 같다.
첫째로 단분자로 존재하는 수용액내 글루카곤의 구조에 대한 연구를 500MHz NMR을 사용하여 수행했다. 수소-중수소 치환실험결과 amide NH의 치환속도가 수소결합을 하는 단단한 구조에 의한 것으로 판단되었다. 온도에 따른 amide NH의 chemical shift변화도 많은 NH가 수소결합을 하고 있음을 나타냈다. 작은 값(6Hz미만) 의 수소 짝지음 상수가 여섯개의 amide NH와 $\alpha$H간에 나타나서 적어도 여섯개의 아미노산이 helical구조를 이루고 있음을 알게 되었다. 이 결과로 부터 농도인 단 분자 상태에서는 구조가 없는 것으로 알려진 글루카곤이 고농도에서 이루는 구조의 모체라 할만한 구조가 있음을 알게되었다.
두번째로 CD와 NMR을 사용하여 물/TFE(1:1, v/v)용액내의 LHRH구조에 관한 연구를 수행하였다. CD실험의 결과에 의하면, LHRH는 산성수용액(pH 3)내에서 구조가 없는 것으로 나타났다. 그러나 정밀한 NMR실험에 의하면 CD에서 관측될 수 없는 turn구조가 존재함을 알 수 있었다. 이 turn구조는 글리신-6과 루이신-7을 중심으로 존재하였다. 중성용액에서는 CD나 NMR에서 동일하게 많은 양의 $\beta$구조가 존재함을 관측할 수 있었다. 특히 NMR실험에 의하면 중성용액에서도 turn구조가 존재하는데, 그 위치는 산성용액에서와 달리 티로신-5와 글리신-6이 중심이 되어 이루어져 있었다. 이와 같이 산성도에 따라 구조가 변하는 것은 히스티딘-2의 잔기의 이온화에 의한 정전기적 반발이 $\beta$구조를 방해하여서 일어나는 것으로 추측된다. LHRH 활성도에 중요한 것으로 추측되고 있던 turn 구조가 변이체가 아닌 LHRH 에서 발견 되었으므로, 앞으로 호르몬 수용체와 결합하는 생리적 구조와 기능을 정확히 아는데 큰 도움이 될 것으로 보인다.
세번째로 대장균 리보스-결합단백질내 신호서열의 돌연변이체와 야생형의 구조적인 차이를 CD와 NMR을 사용하여 알아보았다. 야생형 신호서열펩티드는 N말단의 2번째 아미노산부터 C말단인 20번째 아미노산까지 총 19개의 아미노산의 helix구조를 이루고 있었다. 이러한 구조는 DMSO가 10%첨가된 물/TFE용액에서 관찰되었는데, DMSO는 수소결합을 파괴할 수 있으므로 야생형 신호서열 펩티드는 매우 안정된 이차구조 ($\alpha$-helix)를 가지고 있는 것으로 보인다. 한편 돌연변이체는 물/TFE용액에서 10번째 아미노산부터 20번째 아미노산까지 총 11개의 아미노산이 $\alpha$-helix를 이루는데 그 안정도는 야생형에 비해 떨어진다. 이러한 이차구조길이의 차이는 돌연변이체가 루이신-9대신 프로린으로 치환되어 서 $\alpha$-helix형성을 방해하기 때문으로 보인다. 따라서 신호서열의 생리적 기능은 신호서열내 $\alpha$-helix의 길이에 의해 크게 좌우됨을 알 수 있게 되었다. 다른 종류인 Lamb 신호서열은 야생형에서 $\alpha$-helix의 길이가 C말단으로 진행되었고, 돌연변이체나 야생형 모두 N말단에는 이차구조가 없었다. 이러한 결과들로부터 신호서열의 생리적 기능에는 신호서열내 $\alpha$-helix의 위치보다 크기가 더 중요한 요소임을 알게 되었다.
