Several types of interferons (IFNs) were tested for their ability to suppress TCDD-inducible cytochrome P-450(P-450)-dependent monooxygenase in primary mouse hepatocytes isolated from female B6C3F1, using EROD activity. Mouse IFN $_＼gamma$ markedly suppressed EROD activity with time-and dose-dependency when added at the same time as TCDD, In contrast, mouse IFNα/β was only moderately suppressive. Rat IFN $_＼gamma$ was even more suppressive than mouse; human IFN $_＼gamma$ had no activity. Direct effects of mouse IFN $_＼gamma$ was confirmed using a monoclonal antibody against to this IFN which blocked the action of mouse IFN $_＼gamma$ and purified hepatocytes which were still sensitive to the effect of mouse IFN $_＼gamma$. These results indicate that IFNs, particularly mouse and rat IF $_＼gamma$, can antagonize TCDD-induced P-450 induction and IFNs has subtypes and species specificity in primary mouse hepatocyte cultures.
Selective change in the isoformes of P-450 by mouse IFNγwas investigated. Mouse IFN $_＼gamma$ markedly suppressed a TCDD or 3-MC-inducible EROD activity, which is speific for P-450IA1. in a dose-dependent manner. Suppression of P-450 isoformes by mouse IFN $_＼gamma$ seems to be selective for TCDD-inducible EROD, as neither PB-inducible PROD and aminopyrine N-demethylase nor DEX-inducible erythromycin N-demethylase activities were affected. However, basal EROD and PROD activities were slightly suppressed but aminopyrine N-demethylase activity was not changed and erythromycin N-demethylase activity was increased by mouse IFN $_＼gamma$. These results demonstrate that the effects of mouse IFN $_＼gamma$ on the P450-dependent monooxygenase system are complex, involving differential regulation of several isoformes. Coincidely with above results, microsomal levels of TCDD-inducible P-450IA1 was decreased by mouse IFN $_＼gamma$ but PB-inducible P-450IIB1/2 and DEX-inducible P-450IIIA1 were not changed in immunoblot analyses using monoclonal antibodies specific for these isoformes. Hepatic TCDD-inducible P-450IA1 mRNA was found to be decreased by mouse IFN $_＼gamma$ in RNA hydridization using oligonucleotide probe fo P-450IA1 mRNA. Mouse IFN $_＼gamma$ also reduced specific binding of [$^3H$]TCDD to cultured hepatocytes. These results suggest that mouse IFN $_＼gamma$ selectively decrease P-450IA1 expression, through decreased Ah receptor binding affinity to TCDD, transcriptional inactivation or increased mRNA destabilization.
Mouse IFN $_＼gamma$ markedly suppressed TCDD-inducible EROD activity in mouse primary hepatocyte cultures. Mouse IFN $_＼gamma$, however, had no effect on EROD induction by TCDD in Hepa-1 cells, a mouse hepatoma cell line, or Hepa-1 cells cocultured with Kupffer cells when added directly to the culture. EROD induction by TCDD in Hepa-1 cells was suppressed when cells were cultured with mouse IFN $_＼gamma$-teated mouse hepatocytes conditioned media. The magnitude of suppression was related to the dose of mouse IFN $_＼gamma$ and number of hepatocytes used for the preparation of the conditioned media. Treatment of he monoclonal antibody aginst mouse IFN $_＼gamma$ to the conditioned media did not block the suppression of EROD induction. The suppressive effect on EROD induction, however, was blocked when conditioned media was heated or treated with trypsin. These results suggested that mouse IFN $_＼gamma$-treated mouse hepatocytes may release a soluble protein factor(s) which suppressed the EROD induction by TCDD in Hepa-1 cells.
To determine whether the suppressive effect of mouse IFN $_＼gamma$ and TNFα on P-450-dependent drug metabloism oP-450IA1 ur directly or indirectly we studied the effects of mouse IFN $_＼gamma$ and TNFα on EROD activity. Mouse IFN $_＼gamma$ and TNFα depressed the basal EROD activity in primary mouse hepatocyte and in Perceoll through purified liver parenchymal cell (hepatocyte) cultures and that TNFα, but not mouse IFN $_＼gamma$ showed dose related fashion. Attempts to confirm a direct effects by TNFα and mouse IFN $_＼gamma$ using a mouse hepatoma cell line, Hepa-1, were suP-450IA1 essful. TNFα and mouse IFN $_＼gamma$ reduced the levels of TCDD-preinduced EROD activity in Hepa-1 cells. TNFα and mouse IFN $_＼gamma$ showed additive effect in suppression of EROD activity in this system. In contrast, when mouse IFN $_＼gamma$ or TNFα was added simultaneously with TCDD in mouse hepatocyte cultures, mouse IFN $_＼gamma$ but not TNFα suppress induction. This result suggests that the mechanism of mouse IFN $_＼gamma$-induced depression of liver drug metabolism might be different from that of TNFα. Microsomal levels of P-450IA1 were reduced after treatments of mouse IFN $_＼gamma$ and TNFα in TCDD-preinduced Hepa-1 cells. Furthermore, hepatic P-450IA1 mRNA was decreased to a similar extent as P-450IA1. These results indicating that the reduction of P-450IA1 by mouse IFN $_＼gamma$ or TNFα due to the decrease of this mRNA. These results suggests that deppression of this activity is due to a direct effect of mouse IFN $_＼gamma$ or TNFα in mouse hepatocytes and Hepa-1 cells.
We investigated the role of Ah receptor in suppression of humural immunity by TCDD. TCDD was induced suppression of the antibody response following acute and subchronic exposed to DBA/2 mice, an Ah-low-responsive strain. Suppression of humoral immunity was increased up to 10-fold when TCDD was exposed subchronically compare to that of acute exposure of same does. The increased suppression of the antibody response in subchronic was not aP-450IA1 ompanied by a significant increase in liver microsomal P-450IA1 enzyme (i.e., EROD) activity. These results suggested that the immunosuppression by TCDD in DBA/2 mouse may not be associated with P-450 induction and may not be mediated by the Ah-receptor.
Acute exposure of TCDD produces marked induction of EROD activity in Ah- high-responsive mice (B6C3F1) relative to Af-low-responsive mice (DBA/2). About 40-fold increase in EROD activity was noted in B6C3F1 mice exposed to 4.2 μg/kg TCDD, and ten-fold higher does was required to produce a comparable increase in DBA/a mice. We investiated EROD inducibility by aromatic hydrocabons such as TCDD, 3-MC and βNF in cultured hepatocytes isolated from B6C3F1 and DBA/2 mouse. Direct addition of TCDD to hepatocytes from either strain of mice caused an induction of EROD activity which was both time-, and concentration-dependent. Maximal induction of EROD activity in hepatocytes from B6C3F1 was observed at 96 hr following exposure to 100 pM TCDD, while a 10-fold higher concentration of TCDD was required to produce a comparable level of induction in hepatocytes from DBA/2. Maximal induction in hepatocytes from B6C3F1 mice were observed at 1 μM 3-MC and 1 μM βNF. Meantime, a little, if any induction were oP-450IA1 urred by both chemicals, in hepatocytes from DBA/2. These results indicate that the dependence on Ah receptor mediated processes for induction of P-450IA1 in cultured hepatocytes is identical to that associated with exposure in the whole animal, and suggest that tissue culture conditions, as used in these experiments, do not alter the sensitivity to Ah receptor-dependent mechanisms.
Given the sensitivity of murine lymphocytes to TCDD, it was of interest to determine if human tonsillar lymphocytes could also be modulated by direct exposure to this chlorinated hydrocarbon. Therefor, the effects of TCDD on PWM-induced antibody secretion in murine splenocytes and human tonsillar lymphocytes were examined. No suppression in proliferation and antibody secretion were observed by TCDD in either cells. However, TCDD suppressed the background proliferation without PWM in both murine splenocytes and human tonsillar lymphocytes. TCDD induced EROD in human tonsillar lumphocytes with dose-dependency following stimulation with PWM and phytohemaglutinin, but without these mitogens. The maximum induction was observed at 72 hr. However, EROD was not induced in murine splenocytes under any conditions. These results indicate that enzyme induction and suppression of immune function may have different mechanism in murine and human system.
We compared the effects of TCDD on both antibody response of splenocytes and P-450 enzyme induction (EROD) in primary hepatocytes isolated from B6C3F1 and DBA/a mice when evaluated in the presence of either bovine(FBS and NBCS) or normal mouse sera (NMS). The latter studies with NMS also included cross-over where splenocytes and hepatocytes from B6C3F1 mice were cultured in DBA/2 serum and vice versa. Splenocytes from both strains of mouse are equivalently suppressed antibody responese by TCDD in the presence of NBCS, whereas responses in the presence of NMS show an Ah-dependency that is characterized by a dose-related suppression in the B6C3F1 splenocytes but a lack of suppression in the responses of the DBA/2 splenocytes. Likewise, serum was found to modulate the TCDD-induced EROD activity in primary hepatocyte and was consistent with the effects of TCDD on in vitro antibody responses. This effect was characterized by an enhanced induction of EROD in the presence of NBCS (immunosuppressive condition) and a lower induction in the presence of FCS (non-immunosuppressive condition), each giving the same relative magnitude of induction regardless of the mouse strain used as the source of hepatocyte. In contrast, induction in the presence of NMS showed an Ah-dependency and resulted in a dose-related enhancement in EROD activity in B6C3F1 hepatocytes but decreased activity in the DBA/2 hepatocytes. Cross-over studies showed that the pattern of effects on both hepatocytes and splenocytes was not altered by changing the strain of mouse used as the source of serum, where each gave equivalent results. These findings demonstrate that the Ah-dependency of effects of TCDD on both the in vitro antibody response and P-450 enzyme induction are modulated by the serum environment in which the cells are exposed. The studies with NMS indicate that it is the genotype of the lymphocyte, and not the strain-specific hormone environment, which confers susceptibility to suppression of antibody responses by TCDD. These studies are also important in establishing the use of NMS in evaluating the effects of TCDD on in vitro cellular systems.
본 연구에서는 여러 종류의 인터페론(IFN)들이 TCDD에 의해 유도되는 cytochrome P-450(P-450) 약물 대사 효소인 EROD에 미치는 영향을 B6C3F1 mouse의 간세포 일차 배양을 이용하여 알아보았다. Mouse IFN$\gamma$를 TCDD와 동시에 처리 하였을때 시간, 용량에 의존하여 EROD의 활성도가 크게 억제 되었다. 반면 mouse IFNa/b는 그 작용이 보다 완만하였다. Rat IFN$\gamma$는 mouse IFNg에 비해 억제 정도가 강하였으며, human IFN$\gamma$는 효과가 없었다. Mouse IFN$\gamma$의 직접적인 효과는 mouse IFN$\gamma$에 대한 단일클론항체에 의해 억제작용이 상쇄되었으며, 정제한 간세포에서도 mouse IFN$\gamma$의 효과가 있음을 보임으로서 확인 되었다. 이들 결과는 IFN (특히 mouse와 rat IFN$\gamma$)이 TCDD에 의한 약물 대사 유도를 저해할 수 있으며, subtypes와 종 특이성을 가지는것을 제시 한다. 또한 본 연구에서는 Mouse IFN$\gamma$가 약물 대사의 isoformes에 어떠한 변화를 보이는지를 연구 하였다. Mouse IFN$\gamma$는 TCDD나 3-MC에 의해 유도되는 P-450IAl에 특이적인 EROD 활성도를 크게 억제 시켰다. Mouse IFN$\gamma$에 의한 이러한 억제작용은 EROD에만 특이한 작용으로 보이며 PB에 의해 유도되는 PROD 활성도, aminopyrine N-demethylase 활성도나 DEX에 의해 유도되는 erythromycin Ndemethylase 활성도는 영향을 받지 않았다. 그러나 이들의 기본 활성도에는 다른 경향을 보였다. 즉 EROD와 PROD 경우에는 mouse IFN$\gamma$에 의해 이들 활성도가 억제되었으나 aminopyrine N-demethylase에는 변화가 없었으며 erythromycin N-demethylase는 오히려 약간 증가 하였다. 이러한 결과로 부터 P-450 약물대사 시스템에 대한 mouse IFN$\gamma$의 작용은 매우 복잡하며 여러 isoform이 서로 다른 조절작용을 받는다는 것을 제시 한다. Microsomal P450 apoprotein의 양을 P-450 isoformes에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 immunoblot 분석으로 측정하였을 때 위의 효소활성도 결과와 일치하게 TCDD에 의해 유도된 P-450IAl은 mouse IFN$\gamma$에 의해 감소되었으나 PB에 의해 유도되는 P-450IIB1/2와 DEX에 의해 유도되는 P-450IIIAl에는 변화가 없었다. P-450IAl mRNA의 oligonucleotide probe를 이용한 RNA hybridization 결과 mouse IFN$\gamma$에 의해 TCDD에 의한 P-450IAl mRNA유도가 감소 되었다. 또한 mouse IFN$\gamma$는 [$^3H$]TCDD가 간세포에 결합하는것을 감소 시켰다. 이러한 결과는 mouse IFN$\gamma$가 TCDD의 Ah수용체에 대한 결합 친화도를 감소 시키거나 또는 mRNA의 전사를 막거나 이를 불안정화 시킴으로서 P-450IAl의 발현을 선택적으로 감소 시킴을 제시한다.
Mouse IFN$\gamma$는 mouse hepatoma cell인 Hepa-l cells에서는 TCDD에 의해 유도되는 EROD 활성도에 대한 억제 효과가 없었으며 이는 Kupffer cells과 Hepa-l cells의 공동배양에서도 같은 결과를 보였다. 그러나 Hepa-l cells에서 TCDD에 의해 유도된 EROD 활성도가 mouse IFN$\gamma$를 처리한 mouse 간세포의 conditioned media로 배양했을때 억제되었으며 그 정도는 mouse IFN$\gamma$의 용량과 conditioned media를 만드는데 사용된 간세포의 수에 비례 하였다. Conditioned media에 mouse IFN$\gamma$에 대한 단일클론항체를 처리 하여도 EROD 유도의 억제는 저해되지 않았다. 그러나 conditioned media를 열처리 하거나 trypsin으로 처리하면 억제 효과가 상쇄 되었다. 이러한 결과는 mouse IFN$\gamma$를 처리 하였을 때 mouse 간세포가 단백질 인-자(들)를 유리하며, 이 인자가 Hepa-l cells에서의 TCDD의 EROD 유도를 억제할 수 있음을 제시한다.
Mouse IFN$\gamma$와 종양괴사인자(TNF$\alpha$)의 P-450약물 대사에 대한 억제효과가 직접적인 것을 조사하기 위해 이들의 EROD 활성도에 미치는 영향을 조사 하였다. Mouse IFN$\gamma$와 TNF$\alpha$는 일차 배양 간세포와 Percoll로 정제한 간 실질세포 배양에서 EROD 활성도를 감소시켰다. 간세포 배양에서 이들과 TCDD를 동시에 처리하였을 때 mouse IFN$\gamma$는 TCDD에 의한 EROD 유도를 억제하였으나 TNF$\alpha$는 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 이들의 약물대사 억제 기전이 서로 상이함을 보여 준다. 이들의 작용은 Hepa-l cells에서 TCDD로 유도 된 EROD활성도를 감소시킴으로서 이들의 직접적인 효과가 증명 되었으며 감소 효과는 이들이 상가작용을 가짐이 확인 되었다. 이들은 Hepa-l cells에서 TCDD로 전유도된 P450IAl와 mRNA양을 감소 시켰다. 이러한 결과는 mouse IFN$\gamma$와 TNF$\alpha$에 의한 EROD 활성도와 P-450IAl의 감소가 이 mRNA의 감소에 의한 것임을 시사 한다.
TCDD에 의한 체액성 면역억제에 있어서의 Ah 수용체의 영향에 대해 연구 하였다. TCDD는 Ah-low responsive strain인 DBA/2 mice에서 acute와 subchronic exposure에 의해 항체 반응을 억제 시켰다. 이 체액성 면역의 억제는 TCDD를 subchronical exposure 하였을 때에 같은 용량을 acute exposure 하였을 때 보다 10배 까지 증가 하였다. Subchronic exposure 시의 항체 반응의 억제 증가는 간 microsomal P-450 효소(EROD) 활성도의 증가와는 일치하지 않았다. 이러한 결과는 DBA/2 mouse에서 TCDD에의한 면역 억제가 P-450 유도와는 관계가 없으며 Ah 수용체를 경유하지 않는 기전으로 일어날 수 있다는 사실을 시사한다고 할 수 있다.
Ah-high responsive mice (B6C3Fl)에 TCDD를 acute exposure 하였을 때에는 Ah-low responsive mice (DBA/2)에 비교하여 EROD의 활성도가 크게 증가 하였다. 4.2 $\mu$g/kg 의 TCDD를 B6C3Fl mice에 처리 하였을 때 EROD 활성도는 B6C3Fl에서 40배의 증가를 보였으며 DBA/2에서 유사한 정도의 유도를 위해서는 10배의 TCDD 용량이 필요 하였다. 두 strain 모두 일차 배양 간세포에 TCDD를 직접 처리하였을 때 시간, 용량에 비례하는 EROD 활성도 유도를 유발 하였다. B6C3Fl 에서 EROD 활성도의 최대 유도는 100pM 의 TCDD를 처리한 96시간 후에 관찰 되었다. 반면 DBA/2간세포 배양에서 유사한 정도의 유도를 일으키기 위해서는 10배의 TCDD농도가 필요 하였다. 3-MC와 $\beta$NF에 의한 EROD 활성도의 최대 유도는 B6C3Fl의 간세포 배양에는 각각의 1$\mu$M에서 관찰되었으나 DBA/2간세포 배양에서는 두 물질 모두 B6C3Fl 간세포 배양에 비교하여 유도를 거의 일으키지 않았다. 이러한 결과는 간세포 배양에서도 동물 실험에서와 동일하게 P-450IAl의 유도가 Ah 수용체를 통하여 일어남을 시사하며, 또한 이 실험에서 사용된 조직 배양조건이 Ah 수용체 기전을 변화시키지 않음을 시사한다.
TCDD가 생쥐의 비장세포와 인간의 편도 림포세포에서 PWM에 의해 유도되는 항체생성에 미치는 영향을 조사 하였다. 두세포 모두 TCDD에 의하여 증식과 항체생성이 저해 되지 않았다. 그러나 PWM이 없는 조건에서의 증식은 TCDD에 의해 억제 되었다. PWM과 phytohemagglutinin을 처리한 인간의 편도 림포세포와 비장세포에서 TCDD는 용량에 비례하여 EROD 활성도를 유도시켰으며 최대 유도는 72시간 후에 관찰 되었다. 그러나 이러한 mitogen들이 존재하지 않을 때는 EROD가 유도되지 않았다. 생쥐의 비장세포에서는 어떠한 조건하에서도 EROD 유도가 일어나지 않았다. 이러한 결과는 P-450효소유도와 면역기능의 저해가 생쥐와 인간에서 서로 다른 기전에 의해 이루어짐을 제시한다.
본 실험에서는 TCDD가 B6C3Fl과 DBA/2의 비장세포의 면역반응과 일차배양 간세포의 P-450 유도에 혈청이 각각 어떠한 영향을 미치는가를 연구하였다. 각 실험은 bovine(FCS,NBCS) 또는 normal mouse sera (NMS) 존재하에서 수행 하였다. NMS를 사용한 실험의 경우 B6C3F의 비장세포와 간세포를 DBA/2 혈청하에서의 실험도 함께 하였으며, 그 반대의 경우도 실험 하였다 (cross-over). B6C3Fl와 DBA/2 비장세포 모두 NBCS 존재하에서 TCDD에 의해 같은 정도의 항체반응 억제를 보였다. 반면 NMS 존재하에서의 항체반응은 Ah 의존성을 보였다. 즉 B6C3Fl 비장세포에서는 TCDD 용량에 따른 항체반응이 억제되었으나 DBA/2 비장세포에서는 억제가 일어나지 않았다. 마찬가지로 일차 배양 간세포 에서도 혈청은 TCDD에 의해 유도되는 EROD 활성도를 변화시킴을 발견 하였다. 이러한 효과는 NBCS 존재하에서는 유도가 보다 향상되고 FCS 존재하에서는 유도 정도가 보다 낮게 나타난다는 사실로 특정 지어질수 있었다. 이때 각각의 유도 정도는 간세포 배양에 사용된 mouse의 종류와 관계없이 같은 정도로 나타났다. 반면 NMS 존재 하에서의 유도는 Ah 의존성을 나타냈고 B6C3Fl 간세포에서 용량에 비례한 결과를 보였다. 그러나 DBA/ 2간세포에서는 EROD 활성도의 감소를 보였다. Cross-over연구를 통하여 간세포와 비장세포 모두 NMS 제조에 사용된 mouse의 종류와 관계없이 동일한 결과를 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 in vitro 항체반응과 P-450 효소유도 모두에서 TCDD의 Ah 의존성이 세포를 배양하는 혈청에 따라 변화됨을 입증하며, NMS을 사용한 연구 결과 TCDD에 의한 항체 반응 억제 정도는 종 특이적인 호르몬 환경이 아닌 림포세포의 genotype에 의해 결정됨을 알 수 있었다. 이러한 연구는 in vitro 세포배양계에서의 TCDD의 영향을 평가하는데 있어서 NMS 사용을 확립하는데도 중요할것으로 사료 된다.
