The structural gene for subtilisin J from Bacillus stearothermophilus NCIMB10278 was cloned in Bacillus subtilis using pZ124 as a vector, and its nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence revealed only one large open reading frame, composed of 1,143 base pairs and 381 amino acid residues. A Shine-Dalgarno sequence was found 8 bp upstream from the translation start codon (GTG). The deduced amino acid sequence revealed an N-terminal signal peptide and pro-peptide of 106 residues followed by the mature protein composed of 275 residues. The productivity of subtilisin J in the culture broth of the Bacillus subtilis was about 46-fold higher than that of the Bacillus stearothermophilus. The amino acid sequence deduced from the extracellular alkaline protease subtilisin J is highly homologous to that of subtilisin E and it shows 69% homology with subtilisin Carlsberg, 89% with subtilisin BPN' and 70% with subtilisin DY. Some properties of the subtilisin J with had been purified from the Bacillus subtilis were examined. The subtilisin J has alkaline pH characteristics and a molecular weight of 27,500. All enzymatic properties of the subtilisin J including thermostabilities were similar to those of subtilisin E and subtilisin Amylosacchariticus.
Eight mutations were introduced to study the molecular basis of thermostability of subtilisin J and to analyze the structure-function relationship in the subtilisin J. Among eight mutant proteins, Gln-195 and Asp-49 mutant showed similar activity as wild-type subtilisin. Gln-195 mutant enzyme was expressed in Bacillus subtilis and was purified from the culture supernatant. When the mutant enzyme was expressed at 37℃ in the presence of 2 mM $CaCl_2$, the pattern of enzyme production was quite different from that of wild-type. The purified Gln-195 mutant enzyme was analyzed with respect to optimal temperature, optimal pH, and heat stability. The mutation was found to decrease the heat stability but not catalytic ($K_{cat}$/$K_m$) and optimal pH. This decreased heat stability may be due to the low binding affinity of $Ca_{2+}$ for the Gln-195 mutant subtilisin. In fact, the binding affinity of $Ca_{2+}$ for the Gln-195 mutant decreased 10 times compared with wild-type. On the other hand, Asp-49 mutant produced proteins considerably different from wild-type subtilisin. Surprisingly, in comparison with wild-type subtilisin J, the protease production pattern was dependent on pH. In contrast with wild-type subtilisin. Asp-49 mutant produced two proteins. Molecular weight of the lower-positioned protein was estimated to be about 22,000 and the higher-positioned protein was about 30,000. From the protein sequecing data, the lower-positioned protein may be the deleted protein cleaved at Tyr-58-Gln59 and the higher-positioned protein may be the mature protein begins from the Ala at the N-terminus of the protein.
알칼리성 프로테오제를 클로닝하기 위하여 Bacillus 균주들로 부터 염색체 DNA를 분리한 후 서브틸리신 E를 coding하는 aprE probe를 이용하여 hybridization을 한 결과 B. stearothermophilus NCIMB 10278로부터 ClaI과 EcoRI으로 자른 염색체 절편에서 각각 3.1 kb와 4.8 kb에 해당되는 유전자를 얻었다. 이중 3.1 kb절편을 EcoRI-BamHI으로 자른 2.5 kb 절편만을 B. subtilis DB104에 형질전환시켰다. 확인된 전환체는 PMSF에의해 저해되는 알카리성 serine protease임을 일차적으로 확인하였다. 뉴크레오티드 순서 결정결과 mature protein을 구성하는 총 275개의 아미노산 중에서 두개가, signal sequence에서는 한개 그리고 prosequence에서는 두개의 아미노산이 서브틸리신 E와 다르게 나타났다.
B. subtilis DB104/pZS101로부터 배지로 분비되는 단백질을 순수 분리 정제하여 그 특성을 조사해본 결과 최적 pH는 7.0이었고 최적온도는 $Ca^{2+}$존재시 60℃, 없을 경우 50℃였다. 또한 내열성도 측정해 보았지만 최적온도, 최적 pH 그리고 pH 내성등과 같은 특성들이 서브틸리신 E 및 서브틸리신 Amylosacchariticus의 특성과 매우 유사하여 단백질공학을 통한 구조와 기능간의 관계를 규명해 보고자 했다.
기존의 3차 구조를 토대로 하여 단백질의 내부 또는 표면 가까이에 위치하는 아미노산들 중에서 Glu-195/Gln-195 변이체와 Ser-49/Asp-49 변이체만이 야생형과 유사한 효소 활성을 보였다. Glu-195 아미노산은 3차 구조상에서 weak $Ca^{2+}$ 결합부위에 존재하고 있는데 이 아미노산을 glutamine으로 치환시 $Ca^{2+}$은이 단백질의 내열성에 거의 기여하지 못했으며 $Ca^{2+}$ 결합 친화도는 야생형에 비해 약 10배 정도 감소되었다. 따라서 $Ca^{2+}$이 열에대한 내성을 부여하지 못한것은 $Ca^{2+}$ 결합능력이 감소된데에 기인된 것으로 보이며 결과적으로 Glu-195는 이 아미노산 주위에 $Ca^{2+}$ 결합부위가 존재하고 있어서 단백질을 안정화시키는데 중요한 역할을 하고 있다는 것을 증명하고 있다.
Ser-49아미노산은 Bacilli 유래 서브틸리신 모두에서 보존되어 있는데 이를 aspartic acid로 치환시 야생형과 유사한 활성을 보였지만 그 보다 큰 arginine으로 치환시켰을 때에는 활성을 보이지 않았다. 이 단백질은 SDS-PAGE상에서 야생형보다 분자량이 조금 큰 위치와 작은 위치에 존재하고 있었으며 두 단백질의 상대적인 양은 pH에 의존하는 특성을 보였다. 단백질을 분리 정제해 본 결과 deletion된 것으로 보이는 단백질은 어느 정도 정제가 되었지만 고분자량의 단백질은 거의 분리가 되지 않았다. 아미노산 서열 결정결과 lower-positioned protein은 서브틸리신 J 단백질의 N-말단으로부터 58개가 잘린 deleted mutant 단백질임을 알 수 있었고, higher-positioned protein은 야생형과 배열이 같은 mature protein임을 알 수 있었다.
