Effects of 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA), which is an environmental pollutant, mutagen and carcinogen, on the immune response were investigated using splenocyte culture alone, exogenous metabolic activation system (S-9 fraction and primary cultured hepatocytes obtained from rat liver) in vitro and female BALB/c mice in vivo. Antibody response of splenocytes to LPS(100 g/ml) in 48 hr continuous exposure with DMBA were suppressed in a dose-dependent manner. Chrysen and 1,2-benz[a]anthracene (1,2-BA), structural analogues of DMBA, were used. They were non-immunosuppressive up to 50 μM. 1,2-BA(50 μM) was not able to block DMPC-induced suppressive of antibody response to LPS. But, α-naphthoflavone (ANF, 5 μM) was able to attenuate slightly DMBA-induced suppression of antibody response to LPS. DMBA did not affect the activation step of, but, early step of differentitation. Splenocytes expressed the metabolic capacity to activate DMBA to immunosuppressive metabolites on TLC chromatogram. To investigate the role of exogenous metabolic activation system, we used rat liver S-9 fraction and primary cultured hepatocytes. Two systems were successfully able to produce DMBA-induced immunosuppression in short-time culture. ANF, an inhibitor of cytochrome P-450, revered completely DMBA-induced immunosuppression in two systems to control level, indicating involvement of DMBA metabolism present in two systems. In addition to ANF, addition of exogenous calf thymus DNA(CTD, 2 mg/ml) to coculture medium of rat primary hepatocyted and murine splenocytes reversed completely DMBA-induced immunosuppression. The binding of [$^3H$]DMBA products to splenocyte DNA increased in time-dependent manner and was reduced by ANF (10 μM) in coculture. These results suggest that DMBA metabolites generated in splenocytes exposed to DMBA for 48 hr and in exogenous metabolic activation systems cultured with splenocytes for short-time (1 or 4 hr) could produce immunosuppression by targeting to splenocyte DNA. In in vivo studies, the doses of DMBA producing 20% (ED20) and 80% (ED80) of immunosuppression were 5.2 and 56 mg/kg body weight, respectively. ANF(80 mg/kg, divided into 6 times treatment, i.p.) reversed completely ED80-induced suppression of antibody response to SRBC in vivo. β-naphthoflavone(BNF, 50 mg/kg, divided into 6 times treatment, i. p.) slightly potentiated ED20-induced immunosuppression. On the other hand, butylated hydraxyanisol(BHA) attenuated the DMBA-induced immunosuppression on female BALB/c fed with BHA (0.75% in diet). In conclusion, the metabolism DMBA was suggested to be involved in DMBA-induced immunosuppression in vitro and in vivo.
본 연구에서는 환경유해물질이면서, 돌연변이원, 발암원으로 작용하는 7, 12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)의 면역억제작용을 in vitro 상에서 비장세포자체에서와 S-9 분획물과 일차배양 간세포등의 외부 대사 활성계를 사용하거나 in vivo 로 암컷 BALB/c 쥐를 이용하여 알아보았다.
DMBA 를 48시간동안 계속하여 비장세포에 노출시 다클론성 면역반응이 50 μM까지 농도에 비례하여 억제되었다. 같은 조건하에서 구조유사체인 Chrysen과 1, 2-Benz[a]anthracene (1, 2-BA)은 영향을 주지 않았고, 1, 2-BA의 전처리에의해서 DMBA에 의해 유도된 면역억제가 회복되지 않았다. 그러나 대사저해제인 α-naphthoflavone (5μM) 은 경감효과를 보여 주었다. DMBA 의 노출시간을 달리 하였을 때의 결과로부터, DMBA는 비장세포의 면역반응 과정 중에서 활성화단계보다는 그 이후의 단계를 저해하는 것으로 보인다.
비장세포는 DMBA와의 48시간 노출시 각종의 DMBA 대사물을 생성함이 박막 크로마토그래피상에서 확인되었다. 한편, 외부의 대사활성계의 역활을 알아보기위하여 백쥐로부터 얻은 S-9 분획물과 일차배양 간세포를 사용하였다. 두 대사활성계는 단시간 배양조건에서 DMBA에 의해 유도된 면역억제작용을 발현시켰다. 대사저해제 인 α-Naphthoflavone(10 μM) 은 이 두 대사 활성계에서 DMBA에 의해서 유도된 면역억제를 완전하게 반전시켰다. 이것으로 DMBA의 면역억제작용은 대사활성계내의 약물대사 효소에 의하여 매개됨을 알 수 있었다. ANF 이외에 Calf thymus DNA(2 mg/ml)을 공동배양에 첨가시에도 DMBA에 의한 면역억제는 반전되었다. 또한 [$^3H$]DMBA와 비장세포 DNA와의 결합은 공동배양시간의 증가에 비례하여 증가하였으며 ANF (10 μM) 의 첨가시에 감소한 것으로 보아서 간세포내에서 대사된 DMBA 대사물이 간세포로부터 배지내로 배출된 다음, 비장세포내로 유입되어, 비장세포내의 DNA와 결합한 것으로 사료된다.
In vivo 상의 고찰에서, DMBA의 농도의 증가에 비례하여 면역기능이 억제되었으며 20%의 저해농도 (ED 20) 와 80%의 저해농도 (ED 80)은 각각 5.2 mg/kg 과 56 mg/kg 이었다. 대사저해제인 ANF (80 mg/kg) 는 ED 80에 의해 유도된 면역저해를 대조군과 같은 수준으로 회복시켰다. 한편 Glutathione S-Transferase 의 유도제라고 알려진 Butylated hydroxyanisol (BHA) 를 0.75%로 사료에 섞어서 처치했을 경우에도 역시 DMBA에 의해 유도된 면역억제를 경감시키는 것을 보여주었다. 본 연구결과 in vitro, in vivo 상에서 DMBA의 면역저해에는 대사가 관여하는 것으로 사료된다.
