A number of microorganisms are known to possess a capability of converting nitrile compounds to the corresponding amides. Chapter 1 summarizes the commercial use of acrylamide, its current production methods, the applications of nitrile converting enzymes, the enzyme stabilization by additives, and the immobilization methods for cells.
The acrylonitrile adaptation of Brevibacterium sp. CHI for the increased production of acrylamide was described. A bacterial strain having higher nitrile hydratase activity and acrylonitrile concentration tolerance, numbered Brevibacterium sp. CH2, was developed by repeated subculturing of CH1 strain in the broth containing acrylonitrile with slightly increased acrylonitrile concentration. The specific nitrile hydratase activity of the strain increased up to 32 units/mg cells, 3.2 times higher than that of CH1 strain and the enzyme was not inhibited by the substrate, acrylonitrile concentration of 6%(v/v). The effects of temperature and pH on the activity of the cells were investigated and the substrate specificity of the strain was also studied.
The fed-batch culture of CH2 strain with regulatory substrate feeding gave a cell density of up to 80 g/L and nitrile hydratase activity was maintained at above 22 units/mg cells. The cell growth yield was ca. 0.5g dry wt per g glucose consumed. The total nitrile hydratase activity in the fed-batch culture with the regulatory feeding increased up to 1784 units/ml, which amounted to four times that of the batch culture. The productivity of the enzyme formation and the cell mass in regulatory fed-batch mode greatly increased as compared with batch culture.
The effects of acrylonitrile and acrylamide on the enzyme action of nitrile hydratase of CH1 and CH2 strain used for the biotransformations of nitriles were described. The excessive substrate (acrylonitrile) and product (acrylamide) inhibited the activity of the enzyme competitively. In comparison with 0.2 mol/L of CH1 strain, the substrate inhibition of CH2 strain began to appear only at very high acrylonitrile concentration of 0.91 mol/L. In a packed bed reactor, dispersed plug flow model was proposed proved to be valid by experiment. Also acrylamide productivity extremely decreased beyond acrylamide concentration of 20%(wt/v) in substrate solution.
The optimum culture conditions for high nitrile hydratase activity by CH 2 strain was described. Addition of ferric and ferrous ions greatly increased the nitrile hydratase formation. The effects of nitriles, amides, and acids as possible inducers of nitrile hydratase were investigated. Isobutyramide was the best inducer among the tested compounds. When CH2 strain was cultivated for 23 h at $30\circ{C}$ in a medium containing 15g of glucose, 5g of bacto peptone, 3g of yeast extract, 3g of malt extract, 1g of $KH_2PO_4$, 1g of $K_2HPO_4$, 1g of NaCl, 0.5 g of isobutyramide, 0.2 g of $MgSO_4\cdot7H_2O$, and 0.02 g of $FeSO_4\cdot7H_2O$ per liter of distilled water with pH controlled at 7.1, the maximum total activity was 750 units/ml and the specific activity was 75 units/mg cells. After medium optimization, the specific activity of CH2 strain for 7%(v/v) acrylonitrile increased 2.7 times.
High quality acrylamide was produced using the immobilized cells of CH2 strain in a recycle fed-batch reactor. Effects of a phosphate buffer concentration, pH, acrylonitrile concentration, and various salts on the operational stability of the immobilized cells of CH2 strain in a packed bed reactor were investigated. Effects of salts and carriers on the swelling of the immobilized cells during hydrolysis in a column reactor were also investigated. Immobilization of the cells in Ba-alginate was more desirable than those in polyacrylamide and Ca-alginate from the viewpoiths of the swelling of the immobilized cells and the acrylamide quality. High quality acrylamide was produced using the cells immobilized in Ba-alginate in a recycle fed-batch reactor without use of an isotonic substrate. The conversion yield was nearly 100%, including a trace amount of acrylic acid as a by-product.
Effects of various organic acids and salts on the stabilization of nitrile hydratase of CH2 strain were investigated. The enzyme could be stabilized by the addition of organic acids such as n-butyric acid, isobutyric acid, n-valeric acid, isovaleric acid, and propionic acid. The best stabilizing compound among the tested compounds was n-butyric acid. When n-butyric acid was added at a concentration of higher than 20mM, nitrile hydratase could be completely stabilized at $30\circ{C}$ for 3 hours. The free cells of CH2 strain could be stored for 480 hours or more at $5\circ{C}$without loss of activity in a 0.1M phosphate buffer (pH 7.1) containing 20 mM n-butyric acid.
The high quality acrylamide was produced using the resting cells of CH2 strain in a fed-batch reactors without use of an isotonic substrate. The optimum reaction conditions for acrylamide production by free cells of CH2 strain were: temperature, $10\circ{C}$; acrylonitrile concentration, below 4%(v/v); n-butyric acid concentration, 0,05%(v/v); and pH, 7.1. About 20% of acrylamide was produced after 10 h. The yield of acrylamide was more than 99% and 400g of acrylamide per g cells was produced in a bench scale fed-batch reactor. When reaction by the resting cells was carried out in an aqueous acrylonitrile solution containing 0.05%(v/v) of n-butyric acid, the enzymatic activity was maintained for a long period of time as compared with no addition of n－butyric acid, and efficiently obtained an aqueous solution of high quality acrylamide.
본 논문은 nitrile hydratase 활성의 개선과 $Brevibacterium$ CH2에 의한 아크릴아마이드의 생산에 관한 연구이다. 제 1장에서는 아크릴아마이드의 용도, 아크릴아마이드의 생산방법, 니트릴 전환효소의 응용, 첨가제에 의한 효소의 안정화, 및 균체의 고정화 방법등이 소개되었다.
제 2장에서는 nitrile hydratase의 활성과 아크릴로니트릴에 대한 내성의 향상을 위한 $Brevibacterium$ sp. CH1의 기질적응과 nitrile hydratase의 효율적 생산을 위한 CH2 균주의 고농도 배양에 관한 연구를 수행하였다. $Brevibacterium$ sp. CH1의 기질적응을 통해 nitrile hydratase 활성과 아크릴로니트릴에 대한 내성이 향상된 $Brevibacterium$ sp. CH2를 분리하였다. CH2 균주의 효소활성은 32 units/mg cells로 CH1 균주에 비해 3.2배 증가하였다. 또한 최대 효소활성을 나타내는 아크릴로니트릴의 농도가 CH1의 3%(v/v)에서 6%(v/v)로 증가하여 아크릴로니트릴에 대한 내성이 크게 증가하였다. 이 효소의 최적 반응조건은 pH 7.1, 온도 30℃이었고, 이 조건에서 immobilized cells과 free cells의 활성비는 약 0.6이었다. CH2 균주의 nitrile Hydratase는 acrylonitrile, propionitrile, acetonitrile과 같은 지방족 니트릴뿐만 아니라 nicotinonitrile과 같은 방향족 니트릴에도 높은 활성을 나타냈다.
발효조내의 기질농도를 적절히 조절하면서 CH2 균주를 fed-batch 배양한 결과, 균체 농도가 80 g/L까지 증가하였으며, 효소의 활성도 배양시간에 따라 큰 감소없이 22 units/mg cells로 유지되었다. 이때 총 효소활성은 1784 units/ml broth 로 회분 배양에 비해 4배 증가되었으며, nitrile hydratase의 생산성도 회분배양에 비해 매우 크게 증가하였다.
제 3장에서는 아크릴로니트릴과 아크릴아마이드가 nitrile hydratase의 작용에 미치는 영향을 조사하였다. 과잉의 기질(아크릴로니트릴)과 생산물(아크릴아마이드)은 효소의 활성을 경쟁적으로 저해하였으며, 이를 근거로 반응속도식과 속도상수 (Km, Vmax, Ks, Kp)를 구하였다. CH1 균주가 기질저해를 0.2 mol/L부터 받기 시작하는데 비해, 기질적응을 통해 개발된 CH2 균주는 0.91 mol/L부터 기질저해를 받기 시작하였다. 이러한 CH2 균주의 아크릴로니트릴에 대한 높은 내성은 반응기의 연속조업을 가능하게 할 수 있다. CH2 균주는 아크릴아마이드에 대한 내성도 CH1 균주보다 약간 증가하였다. CH2 균주의 아크릴아마이드에 대한 내성 증가는 아크릴아마이드의 생물학적 생산에 흥미 있는 개선의 하나이다.
제 4장에서는 nitrile hydratase의 효율적 생산을 위한 CH2 균주의 최적 배양조건을 조사하였다. 효소의 형성과 균체성장의 관점에서 탄소원으로는 포도당, 질소원으로는 bacto peptone, yeast extract, malt extract를 포함하는 complex nitrogen을 사용할 경우가 최적이었다. Nitrile hydratase의 활성은 $FeSO_4$와 $FeCl_3$의 첨가에 의해 크게 증가되었으며, 최고의 총활성을 얻기 위한 $FeSO_4\;\cdot\;7H_2O$의 농도는 0.02 g/L였다. 이 결과로부터 CH2 균주의 nitrile hydratase 활성을 높이기 위해서는 Fe ion의 첨가가 필수적이며, CH2 균주의 nitrile hydratase는 cofactor로 Fe ion을 필요로 함을 추측할 수 있었다. Nitrile hydratase의 inducer로써 nitriles, amides, acids의 영향에 관한 연구결과, isobutyramide가 가장 좋은 inducer였으며 최적 농도는 0.5 g/L였다. CH2 균주를 이상의 최적배지 (glucose 15 g/L, bacto peptone 5 g/L, malt extract 3 g/L, yeast extract 3 g/L, $K_2HPO_4$ 1 g/L, $KH_2PO_4$ 1 g/L, NaCl 1 g/L, isobutyramide 0.5 g/L, $MgSO_4\;\cdot\;7H_2O$ 0.2 g/L, $FeSO_4\;\cdot\;7H_2O$ 0.02 g/L) 및 최적 배양조건 (30 $^\circ$C, pH 7.1)하에서 23 h 배양하였을 때 7%(v/v) 아크릴로니트릴에 대한 총활성은 750 units/ml broth 이었고, 효소의 비활성은 75 units/mg cells 이었다. 배지의 최적화 후에 7%(v/v) 아크릴로니트릴에 대한 CH2 균주의 nitrile hydratase의 비활성은 2.7배 증가하였다. 회분식 배양 결과 nitrile hydratase의 활성은 균주의 성장과 함께 증가하여 성장이 거의 끝났을 때 활성이 최대였으며, 그 이후에는 활성이 감소하여 60 units/mg cells로 유지되었다. pH의 조절은 균체의 성장과 활성을 10% 이상 향상시켰으며, exponential growth phase에서의 maximun specific growth rate는 0.16 $h^{-1}$이었다.
제 5장에서는 재순환 fed-batch 반응기에서 고정화 균체에 의한 고품질의 아크릴아마이드의 생산, nitrile hydratase의 안정화, fed-batch 반응기에서 resting cells에 의한 고품질의 아크릴아마이드의 생산 및 bench scale fed-batch 반응기에서 resting cells에 의한 고품질의 아크릴아마이드의 생산 등에 관한 연구를 수행하였다. 고정화 bead에 의한 아크릴아마이드 생산시 실험실 규모에서는 saline solution이나 phosphate buffer등을 사용하는데 이 경우에는 bead의 swelling이 일어나지 않아 장기간 조업이 가능하였다. 그러나 이와 같은 isotonic substrate의 사용은 많은 양의 NaCl이나 phosphate등이 생산물인 아크릴아마이드 용액에 섞여 나온다. 이것은 생산물의 품질면에서 본다면 바람직하지 못한 불순물이며, 특히 고분자량을 가지는 acrylamide based polymer 생산시에 phosphate의 존재는 생성된 고분자의 불용성의 원인이 된다. 이러한 문제로 인해 염의 제거를 위해서는 이온교환처리 등의 후처리 공정이 필요하게 되는데, 이는 고정화 세포를 이용한 생물학적 아크릴아마이드 생산방법의 장점인, 특별한 정제과정없이 고순도의 생산물을 얻을 수 있다는 것과 정제비용이 필요없다는 장점을 살리지 못하게 된다. 반면에 이러한 isotonic substrate를 사용하지 않으면 nitrile의 수화반응중 심각한 bead의 swelling이 일어나 장기간의 조업이 불가능하게 된다.
반응 혼합물에 0.1% sodium acrylate나 $5\times10^{-4}$M $CaCl_2$등의 첨가는 생산물의 품질에 큰 영향을 미치지 않고 polyacrylamide bead의 swelling을 일으키지는 않았으나, 이들 염 자체가 효소의 활성을 저하 시키는 요인으로 작용하여 장기간 조업이 불가능하였다. Ba-alginate bead의 경우 초기에는 swelling이 일어나지 않았으나 재순환 유가식 반응기 조업시, 시간이 지나면서 고농도의 아크릴아마이드와 Ba 이온의 누출 등에 의해 bead가 swelling되어 장기간 조업이 불가능하였다. 따라서 고정화 bead에 의한 아크릴아마이드 생산의 생산성을 높이기 위해서는 buffer나 saline등 의 isotonic substrate를 사용하지 않아도 bead의 swelling이 일어나지 않는 고정화 방법의 개발이 요구된다. 효소 안정화를 위해 각종 유기산의 효과를 살펴보았으며, 가장 좋은 효소 안정화제는 n-butyric acid였고, 최적 농도는 20 mM 이었다. n-Butyric acid의 사용으로 free cells의 저장 안정성이 현저히 향상되었으며, 5 ℃에서 약 480 시간 동안 효소활성의 감소없이 저장이 가능하였다. Resting cells에 의한 아크릴아마이드 생산을 위한 최적 반응 조건은 온도 10 ℃, 아크릴로니트릴 농도 3%(v/v)이하, n-butyric acid 농도 0.05%(v/v), pH 7.1이었으며, bench scale 반응기(12 L)에서 균체 6 g을 이용하여 20%의 아크릴아마이드를 얻었다. 그러나 이 경우 아크릴아마이드 농도가 20% 근처에 도달하면 아크릴아마이드에 의해 효소가 심하게 inhibition 받아 더이상의 반응이 진행되지 않았다. Bench scale 반응기에서 균체 1 g당 400 g의 아크릴아마이드를 얻었으며, 20% 아크릴아마이드의 생산성은 20 g/(g cellsㆍ˙˙Lㆍh) 이었다. 이는 효소활성이 높고 생산물인 아크릴아마이드에 높은 내성을 가지는 균주의 screening 및 균체 고정화 방법의 개발등에 의해 향상시킬 수 있을 것이다.
