For the development of the fermentation process for a high viscosity exopolysaccharide, Methylan, production by Methylobacterium organophilum from methanol, the effects of environmental factors and fermentation variables on cell growth and Methylan production were investigated in fed-batch culture and kinetic modelling was also attempted to illustrate the fermentation data.
The concentrations of cell and Methylan were maximum at $30\circ \!C$ and pH 7. The high temperature and high pH such as $36\circ \!C$ and pH 8 reduced significantly the viscosity of Methylan solution. However, high aeration rate and agitation speed and longer fermentation time were favorable for the enhanced viscosity of Methylan solution at the same concentration. It means that environmental factors affect significantly the degree of polymerization of Methylan.
Effect of the concentration of ammonium ion was investigated in fed - batch cultures. Cell growth increased proportionally to the initial concentration of ammonium ion in the medium. However, Methylan production was inhibited remarkably by the high concentration of ammonium ion. Therefore, it was necessary to feed continuously the nitrogen source for the higher production of Methylan. In order to determine the feeding method of nitrogen source, fed-batch cultures using media with different C/N ratios (methanol/ammonium ion) were carried out. The higher values of C/N resulted in the lower cell growth rate and the higher production rate of Methylan. For the increase of Methylan concentration, the C/N ratio must be changed from lower value to higher value (only C fed), after cell growth reached the desired level. By feeding ammonium ions within the desired level (usually 0.45g/l) during the exponential phase, Methylan concentration if fed-batch culture could be increased up to 12.5g/l. Cells grew continuously through the gaseous nitrogen assimilation even after the ammonium ion supplied to the medium was depleted. At this phase, molybdenum played an important role to increase the Methylan production.
From an experiment in a multi-disc mixer providing defined shear rate and shear stress, it was found that the specific production rate of Methylan increased with increasing shear stress within the range of 30 Pa (60l/s of shear rate), and, the specific production rate was constant beyond 30 Pa (60l/s). It suggests that the mass transfer from the medium into the cells may limit Methylan production when shear stress is less than 30 Pa. For the enhanced production of Methylan, a novel bioreactor having a large volume of high shear was tested. The concentration of ammonium ion was kept in the medium below 0.15g/l during the culture. The final concentrations of cell and Methylan in the novel bioreactor were 31g/l and 20.6g/l, respectively. They were enhanced by 20\% and 60\%, respectively, compared with those obtained in a conventional fermentor. At this Methylan concentration, consistency index was 127 $Pa \cdot {s^n}$ which corresponded to 68g/l of Xanthan.
Model equations were proposed to illustrate the kinetics of cell growth and Methylan production under nitrogen limitation. The proposed equations appeared to explain well the growth charcteristics that M. organophilum grew continuously through gaseous nitrogen even after the depletion of ammonium ion supplied to the medium and showed the good agreement with the experimental data on the change of cell growth, Methylan and ammonium ion during the culture.
Methylobacterium organophilum을 이용하여 메탄올로 부터 고점도성 다당류인 Methylan을 생산할 수 있는 발효 공정을 개발하기 위하여 환경 인자와 여러 가지 발효 공정의 변수가 Methylan 생산에 미치는 영향을 조사 하였으며, Methylan 발효에 대한 동력학적 모사도 시도 하였다.
세포 증식 및 Methylan 생성은 온도 $30\circ \!C$와 pH 7에서 최대농도를 보였다. 온도 $36\circ \!C$나 pH 8와 같은 높은 온도와 높은 pH 조건 하에서는 Methylan 용액의 점도가 감소 하였으나 반면에 통기량 및 교반 속도와 배양 시간을 증가 시키면 같은 농도에서 점도가 증가된 Methylan을 얻었다. 이것은 환경 인자가 Methylan의 중합 정도를 조절 할 수 있다는 것을 의미한다.
Methylan발효에 관한 질소원의 농도 영향을 유가식 배양법에서 살펴 보았다. 세포는 배양 초기에 첨가한 질소원의 농도에 비례적으로 증가 하였으나, Methlan생산은 첨가한 질소원의 농도가 어느 수준 이상으로 증가하면 현저히 감소하였다. 그러므로, Methylan의 생산 농도를 증가 시키기 위해서는 질소원의 농도를 적정 수준으로 조절할 수 있는 연속 공급 방법의 개발이 필요 하였다. 질소원의 농도를 조절하여 첨가하는 방법을 결정하기 위해 C/N 비율이 각각 다른 여러 가지 배지를 DO-stat에 의하여 첨가하는 유가식 배양을 하였다. 높은 C/N 비율의 배지를 첨가한 결과 Methylan의 생산속도는 높아지고 세포의 증식 속도는 낮아졌다. 이것은 Methylan의 생산성을 증가시키려면, 세포가 어느 정도 증식하였을때 배지중 C/N 비율을 높이기 위하여 C만 첨가해야 한다는 것을 의미한다. 그러므로 대수 증식기에 질소원을 일정 농도 (암모니아 농도 = 0.45g/l) 이하로 유지시키면서 공급하는 유가식 배양법으로 Methylan 농도를 12.5g/l까지 증가시켰다. 이 이상의 농도는 고점도로 인하여 상용의 발효조로는 불가능하였다. 유가식 배양에 있어서 세포는 배지에 첨가된 질소원이 고갈된 후에도 공기중 기체상태의 질소를 통하여 증식을 계속하였고 이때의 질소고정은 배양액의 분석을 통하여 확인할 수 있었다. 이때 몰리브텐이 생산에 가장 큰 영향을 주는 인자임을 발견 하였다.
전단 속도와 전단 응력을 알 수 있는 다중판 혼합기 (multi-disc mixer)로 실험한 결과, Methylan의 비생산 속도는 전단응력 30Pa (전단속도 60 l/s) 이내에서는 비례적으로 증가하나 30Pa 이상에서는 비생산 속도가 일정함을 보여주었다. 이것은 전단응력이 30Pa이하에서는 세포 주변에 생긴 Methylan 층 때문에 배지에서 세포로 물질전달이 제한된다는 것을 의미한다. 고농도의 Methylan을 생산하기 위하여, 높은 전단 지역이 많은 생물반응기를 제작하여 Methylan 생산에 응용하였다. 생물반응기에서의 배양중 암모니아 농도는 0.15g/l 이하로 유지하였고, 최종 세포 및 Methylan 농도를 각각 31g/l 와 12.5g/l 로 얻을 수 있었다. 이 Methylan농도에서의 점도는 Xanthan 68g/l에 해당 되는 127 $Pa\cdot {s^n}$이였다.
질소원의 제한조건 하에서 Methylan발효를 모사하기 위하여 수식을 제안하였다. 제안된 수식은 배지에 첨가된 질소원이 고갈된 후에도 공기중의 질소를 통하여 계속하여 자라는 M. organophilum의 세포특성을 잘 설명하여 주었다. 이 모사식은 세포 증식, Methylan 생산과 기질 소비에 대한 실험 결과와 잘 일치 됨을 보여주었다.
