Streptomyces griseus trypsin (EC 3.4.21.4) is one of the major extracellular proteinases, which is secreted by S. griseus. The coding gene of S. griseus trypsin (sprT) of S. griseus ATCC 10137 was cloned into the pUC 18. Transformants containing sprT were isolated from genomic library by using a synthetic oligonucleotide probe and characterized by direct gel hybridization and demonstrated a proteolytic activity in S. lividans 66. The intact proteinase gene could be delimited to a 1.8 kbp BglI fragment. The sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoreses of extracellular proteins produced by S. lividans 66 harboring pSGT, which is a pUJ718-2 derivative containing a 1.8 kbp BglI fragment, showed that the protein band responsible for the proteinase activity was located at the same position of the S. griseus trypsin purified from a pronase. Deduced amino acid sequence from the nucleotide sequence suggests that S. griseus trypsin is produced as a precursor, consisting of three portions; an amino-terminal pre sequence (32 amino acid residues), a pro sequence (4 residues), and mature trypsin. The S. griseus trypsin consists of 223 amino acids with a computed molecular weight of 23,112. The G+C content of the sprT is 72%. The promoter-like sequence and a putative ribosomal binding site are followed by the coding sequence of S. griseus trypsin. Following a stop codon (TGA), a structure reminiscent of the Escherichia coli rho-independent transcriptional terminator exists. The predicted amino acid sequence of S. griseus trypsin differs from the published amino acid sequence [Olafson et al. (1975) Biochemistry 14, 1168-1177]. It should be corrected by the insertion of two serine residues near position 76(Ser) according to the numbering of α-chymotypsin. The existence of the proline residues at pro and mature junction suggests that the processing of S. griseus trypsin is non-autocatalytic. This is the first report of the nucleotide sequence for a microbial trypsin.
The expression vector for S. griseus trypsin has been construct for easier handling of plasmids and fast obtaining expression products. The only pro-mature coding sequence of sprT obtained by polymerase chain reaction was subcloned into the secretion vector pIN-III-ompA-Hind [Rentier-Delrue et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 8926]. When this vector, pET-F, was expressed in E. cole, a new 26 kilodaltons protein was accumulated in periplasmic space to about 6% of the total soluble fraction. While another vector mutated at pro and mature junction from proline to arginine, pET-F(R), was expressed, two bands were discovered near the band of standard S. griseus trypsin (26 kilodaltons). Because the expression product by pET-F(R) can provide the scissile bond, two bands observed hints that the activation of this mutant protein may be self-catalytic. New T7 phage promoter based secretion vector, pSTO-E, which is a general purpose vector for a foreign gene to secret the translational product into periplasmic space in E. coli, was constructed. This vector comprises ColEl replicon replicon of pUC19, a phage T7 promoter, ompA signal sequence and multiple cloning sites, and a phage T7, transcriptional terminator.
본 연구에서는 혈전증 치료제로 사용되고 있는 스트렙토키나제와 미생물 단백분해 효소간의 구조 및 기능의 관계를 진화의 관점에서 접근하고자, 그 기초 연구로 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신 Streptomyces griseus trypsin, SGT) 유전자를 클로닝하였다. 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신 (E.C.3.4.21.4)은 Streptomyces griseus가 분비하는 단백분해효소 집합체인 pronase중 하나이다. 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신 유전자 (sprT)를 함유하는 형질변환체는 합성염기 탐침으로 S. griseus ATCC 10137의 genomic library로 부터 선별하였으며, 이 유전자를 함유하는 S.lividans TK24 형질변환체는 단백질 분해능력이 있음을 확인하였다. 단백질 분해능력 이 있는 유전자의 절편은 1.8 kbp의 크기를 가진 것으로 확인되었으며, 이 절편을 대장균과 스트렙토마이세스 shuttle vector인 pUJ718-2로 subcloning 하였다. 이 벡타를 함유하는 S. lividans TK24의 형질변환체는 pronase에서 정제한 트립신과 동일한 크기인 26 kD의 단백 분해능력이 있는 단백질을 분비하는 것으로 확인되었다. 이 절편을 염기배열 분석한 결과를 토대로 유추한 결과 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신은 3부분으로 구성된 전구체로 생성된 다고 판단된다. 즉, N-terminal의 pre-sequence (32 개 아미노산), pro-sequence (4개 아미노산), 그리고 트립신 으로 구성되여 있다. 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신은 223개의 아미노산으로 구성되어 있고 이의 분자량은 23,112로 추정된다. 추정된 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신의 아미노산의 배열순서는 이미 보고된 아미노산 배열순서 [Olafson et al. (1975) Biochemistry 14, 1168-1177]에 두개의 serine이 76번 근처의 serine이 추가로 존재함을 보여주고 있다. 다른 단백분해효소와는 다르게 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신의 pre와 pro-sequence 연결부위는 proline이 존재하여 자체로 절단 해서 활성화 할 수는 없다고 추정된다.
스트렙토마이세스 그리세우스 트립신의 분리 정제를 용이하게 하고 이 전에 클로닝한 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 A와 B를 포함하여 단백분해효소 전구체로 부터 활성을 가진 단백분해효소로의 변환과정을 연구하기 위한 도구로서 대장균에서 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신을 발현하는 벡타를 개발하였다. 이 벡타는 대장균의 주된 외막단백질 중 하나 인 OmpA의 signal peptide를 가진 분비벡타인 pIN-III-ompA-Hind [Rentier-Delrue et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 8926] 를 토대로 개발되었다. 이 벡타를 대장균에서 발현시켰을 때 가용성 총단백질의 약 6 % 정도까지 26 kD 크기의 새로운 단백질이 생성되었다. 반면에 pro-sequence와 트립신사이의 연결부위가 proline에서 arginine으로 변환되었다고 믿어지는 인공변환 트립신을 대장균에 발현시켰을 때에는 26 kD 크기의 두 개의 새로운 단백질이 생성되었다. 이 인공변환 트립신은 자체로 절단이 가능한 연결부위가 존재할 수 있기 때문에 두개의 새로운 단백질의 존재는 이 인공변환 단백질의 활성화가 자체로 이루워 진다는 것을 암시한다. 한편 이 발현벡타의 취급성을 용이하게 하고 발현물질의 생성양을 증가시키기 위하여 새로운 범용의 대장균용 분비벡타를 개발 하였다. 이 벡타는 발현단위가 380 bp로 작고 pUC19의 replicon을 도입하여 그 전체 크기가 3.05 kbp로 매우 작다. 이 벡타의 발현단위는 T7파지의 전사촉진제와 전사종결제, OmpA signal sequence, 그리고 여러 곳의 클로닝 위치로 구성되어 있으며, 어떠한 유전자도 추가의 삭제돌연변이 과정이 없이 전사 프레임에 맞춰 삽입이 가능하게 고안되었다.
