Bacteriophage T7 RNA polymerase actively and selectively directs transcription from a highly specific promoter that is unlikely to be found in DNA unrelated to T7. This selectivity provides the basis for gene expression system in E. coli and potentially in a variety of cell types. Here the α-amylase gene of B. licheniformis was expressed by T7 expression system in E. coli and S. cerevisiae. To utilize T7 RNA polymerase in this expression, its gene was introduced into the chromosome in each cell. Then vectors containing α-amylase gene under the control of a T7 promoter were constructed. E. coli BL21(DE3) transformed with pKS01 or pKS02 was seen to grow very slowly or died. It may be due to the basal level of T7 RNA polymerase in uninduced state. And BL21(DE3) containing pKS01 or pKS02 together with T7 lysozyme gene produced α-amylase, and stably maintained. On the other hand in E. coli not containing T7 RNA polymerase gene, expression of α-amylase gene behind the T7 promoter was shown. We found that T7 promoter used in our experiment contains a fragment recognized by E. coli RNA polymerase. S. cerevisiae YK71-N containing YpKS01 or YpKS02 did not produce α-amylase, but produced significant amounts of its mRNA. This result indicates that the gene is sufficiently transcribed in yeast by the T7 expression system, but posttranslational processes were in defect.
박테리오파아지 T7의 RNA 중합효소는 그 활성이 다른 RNA 중합효소에 비해 매우 높고 또한 선택적이어서 대장균이나 그밖의 여러 생체내에서 특정한 유전자를 과잉 발현시킬 때 많이 사용되어 왔다. 대장균과 효모에서 T7 발현체계를 이용하여 α-아밀라아제 유전자를 발현시키기 위하여 그 유전자를 T7 전사 촉진제 아래에 위치하도록 조합한 플라즈미드 pKS01 과 pKS02 를 만들었다. 또한 효모내에서 발현시키기 위해 YpKS01과 YpKS02를 만들었다. pKS01과 pKS02를 각각 T7 RNA 중합효소 유전자가 염색체내에 포함되어 있는 대장균, BL21(DE3)에 도입시켜 본 결과 세포 상태의 불안정성으로 인해 세포가 죽었다. 그러나 plate 상에서는 성장이 가능하였으므로, 그 곳에서 알파-아밀라아제의 생성 여부를 정성적으로 관찰하였다. 그리고 T7 RNA 중합효소 유전자가 존재하고 있지 않은 일반 대장균에 pKS01과 pKS02를 각각 도입시켜 본 결과, 적은 양의 α-아밀라아제가 생성되고 있음을 확인하였다. 여기서 사용한 T7 전사 촉진제의 주변 염기 서열에 대장균의 RNA 중합효소가 작용할 수 있는 서열이 존재함을 알았다. 그리고 효모(YK71-N)에서 T7 발현체계에 의해 α-아밀라아제 유전자를 발현시켰을 때 최종 발현산물이 얻어지지 않았다. 그러나 α-아밀라아제 유전자의 mRNA는 생산하고 있음을 확인하였다. 이로써, 효모에서 T7 발현체계에 의해 특정 유전자를 발현시키는 데에 있어서는 전사 이후의 과정이 잘 이루어지지 않음을 알았다. 대장균 BL21(DE3) 균주에 pKS01 또는 pKS02를 도입 시켰을때 세포 상태가 불안정하여 죽는 상황을 개선시키기 위해 각각의 세포에 T7 lysozyme 유전자를 도입시켰다. 그 결과 세포는 안정하게 유지되면서 α-아밀라아제를 생성하고 있음을 관찰하였다.
