Human hepatocytes in suspension or in primary culture provide an useful model for xenobiotic metabolism study and toxicity assays. A major problem with studies of human liver is the limited supply of fresh normal human liver and its irregular availability. As a preliminary step to using human hepatocytes, various factors of cryopreservation procedure were investigated using adult rat hepatocytes. The viability assessed by trypan blue exclusion was optimal using dimethylsulfoxide at concentration of 10%(v/v), an ultrarapid freezing procedure, and a quick thawing protocol at 37℃. Using this method the recovery of hepatocytes was 68% and the cell viability was 58%. The post-thaw viability was not varied until 35 days. Hepatocytes recovered from the ultrarapid freezing and thawing had a relatively high activity in ethoxyresorufin 0-deethylase compared to that of the fresh hepatocytes during 4-hr suspension culture. 7-Ethoxycoumarin 0-deethylase and pentoxyresorufin 0-dealkylase activities were similar to those of the freshly prepared suspension culture. 7-Ethoxycoumarin was used as a substrate to measure integrated xenobiotic metabolizing activity by hepatocytes on suspension culture. Total 7-hydroxycoumarin formation, a mixed function oxidase activity, was maintained in cryopreserved hepatocytes at 95% and conjugate formation at 35% of activity in fresh hepatocytes. It is concluded that cryopreservation offers a way of storing rat hepatocytes, at least, for short-term toxicity studies performed on suspension culture system.
인간 간세포를 현탁 배양하거나 부착시켜 일차 배양하는 것은 약물 대사 연구와 독성 시험을 하기 위한 좋은 방법이라 할 수 있다. 인간 간세포를 사용한 연구의 가장 큰 문제점은 정상적인 인간 간세포를 얻는 수 있는 양이 아주 소량에 불과하며, 그 시기가 불규칙적 이라는 점이다. 따라서 이런 단점을 극복 하기 위하여 저장 방법을 개발할 필요성을 절실히 느꼈다. 본 연구에서는 그 예비적인 단계로서 흰 쥐 간세포를 사용하여 냉동보존법에 관계되는 여러 가지 사항들을 조사하였다. Trypan blue 배출 방법으로 측정되어진 세포 생존율은 10%의 dimethysulfoxide, 초고속 빙결법, 37℃에서의 빠른 해빙법을 사용하였을 경우에 적절하였다. 이 방법을 사용하였을 때, 간세포 회수율은 68% 이었고 간세포 생존율은 58% 이었다. 해빙후의 세포 생존율은 35일까지 저장하였어도 크게 변화가 없었다. 냉동보존되었던 간세포는 정상적인 간세포에 비하여 4시간 현탁 배양 동안 상대적으로 높은 ethoxyresorufin 0-deethylase activity를 보였다. 7-Ethoxycoumarin 0-deethylase와 pentoxyresorufin 0-deethylase의 활성도는 서로가 유사 하였다. 현탁 배양 상태에서 간세포에 의한 외부 물질의 대사 활성도를 조사하기 위하여 7-etoxycoumarin을 기질로 사용하였다. 혼합 기능 oxidase 활성도를 나타내는 총 7-hydroxycoumarin 생성 능력은 냉동보존되었던 간세포가 정상적인 간세포 활성도의 95%를 보였고, conjugate 생성 능력은 65% 감소를 나타내었다. 이런 냉동보존법의 사용을 위해서는 몇 가지의 연구가 더 수행되어져야 할 필요성은 있으나 적어도 현탁 배양상태에서 독성 시험을 위한 백 쥐 간세포 저장법의 방향을 제시해 준다고 하겠다.
