Urokinase (EC.3.4.21.31), a serine protease, has been used clinically for treatment of thrombosis and/or vascular obstructions. The in vivo half life of urokinase, however, is very short and hence large amounts of urokinase and repeated injections are required for enough fibrinolytic potential in vivo, which causes some side effects.
To improve these disadvantages of urokinase, the modification of urokinase was performed by using methoxy-polyethyleneglycol activated with cyanuric chloride. The degrees of modification were determined by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonate methods and the activity of urokinase was assayed by S-2444 chromogenic methods. The remaining activity of urokinase after modification was reduced as the degrees of modification increased and the in vitro stability of modified-urokinase after incubation in human serum was much larger than native urokinase's.
The heat-stability of urokinase could be increased by polyethyleneglycolmodification but pH-stability of urokinase was relatively independent on modification except for a slight resistance of modified-urokinase to extreme alkaline pH. The modification of urokinase with polyethyleneglycol caused a significant decrease of antigenicity presumably by masking of antigenic sites of modified urokinases. The in vivo stability of urokinase was investigated in rats and it was observed that the half life of modified urokinases was increased with modification degrees. From these results possible effects of polyethyleneglycol moieties of modified-uorkinase on both in vitro and in vivo stabilities of urokinase activity and the possibility of clinical usage of methoxy polyethyleneglycol-modified urokinases are discussed.
혈전증 치료제로 쓰이고 있는 유로키나제는 생체 내 반감기가 매우 짧으므로 실제 임상에서 사용하는데 많은 어려움을 겪고 있다. 본 실험에서는 유로키나제의 생체 내 안정성을 증가시키기 위하여, 폴리에틸렌글라이콜을 아미노산 lysine 잔기에 결합시키므로써 변형된 유로키나제 인 PEG-UK를 제조하였다. 이때 폴리에틸렌엔글라이콜로 변형되는 정도를 조절해 주므로써 다양한 PEG-UK를 만들고 그 성질을 비교 분석하였다.
Cyanuric chloride로 활성화된 메톡시 폴리에틸렌글라이콜과, 유로키나제에 존재하는 아미노산lysine 잔기의 몰 비를 0.1-2.0에서 변형시킨 결과, 약 50%의 변형 수율을 보였으며, 몰 비가 증가할수록 유로키나제의 변형 정도는 증가하고, 변형된 유로키나제의 잔존 효소 활성도는 감소함을 알 수 있었다. 효소 Kinetic parameters를 Lineweaver-Burk Plots으로 구한 결과고, PEG-UK의 기질(S-2444)에 대한 Km 값은 10-30% 증가하였고 Vmax 값은 70% 감소하였다.
사람 혈청 (생체 외)에서의 유로키나제 안정성은 PEG-UK의 경우가 자연의 유로키나제에 비해 시간이 많이 지날수록 우수하였고, 열에 대한 안정성도 고온에서의 PEG-UK의 우수성을 확인할 수 있었다. 그러나 자연의 유로키나제가 tris saline 완충 용액에서 상당한 안정성을 유지하므로 PEG-UK와의 커다란 차이는 나타내지 않았고, pH에 대한 저항성에서도 뚜렷한 차이를 확인할 수 없었지만 pH 10 이상의 강 염기에서는 PEG-UK가 더 많은 저항성을 나타냄을 알 수 있었다.
폴리에틸렌글라이콜에 의하여 항원성이 감소하는 것은 효소면역 측정법으로 알 수 있었는데, 2.6 % 변형된 PEG-UK의 경우 36%의 항원성만 유지하고 있었으므로 PEG-UK의 폴리에틸렌글라이콜 부분이 쉽게 항원성 부위를 방해할 수 있음을 알 수 있다.
유로키나제의 생체 내 안정성을 쥐(rats)에서 조사하였는데, 변형 정도가 커질수록 혈청으로 회수되는 효소 활성도의 반감기는 증가하여, 0.67 몰 비로 만든 PEG-UK의 경우 자연의 유로키나제에 비해 약 10 배의 생체 내 안정성을 나타내게 된다. 이 PEG-UK가 35%의 잔존 효소 활성도를 갖는 것을 고려해 본다면, 폴리에틸렌글라이콜로 유로키나제를 변형시키므로써 결과적으로 약 3.5 배의 생체 내 효소 활성도를 나타내는 PEG-UK를 제조할 수 있는 것이 된다.
