Several proteins were overproduced by the powerful T7 expression system, and their solubility and enzyme activity were determined. Also effects of a chaperone GroEL on chloramphenicol acetyltransferase (CAT) assembly and β-lactamase solubility were investigated in this study.
Using promoter specificity and strong transcriptional activity of phage T7 RNA polymerase, selective overproductions of CAT, β-lactamase, GroEL and GroES were accomplished at high levels in E. coli BL21(DE3) which carries the IPTG inducible T7 RNA polymerase gene in the chromosome. CAT, GroES and GroEL were completely soluble, and overproduced CAT was fully active, Precursor forms of β-lactamase in cytoplasm were mostly insoluble and mature forms in periplasm were mostly soluble.
Next, interaction between GroEL and CAT, or GroEL and β-lactamase was investigated. In the CAT overproducing strain with wild type GroEL, defects of CAT activity was not observed. Overproduction of GroE proteins either by a heat shock or from multiple copies of the gene did not increase CAT specific activity. Also two different mutations of GroEL did not have an effect. In-all cases the CAT specific activity was shown olny as much as it was produced. Thus, GroEL does not seem to be critical in vivo in the assembly and active structure formation of CAT, although they have been previously shown to interact with each other in vitro.
Although GroEL interacts with β-lactamase both in vitro and in vivo, overproduced GroEL proteins did not change insoluble precursor forms of β-lactamase in the cytoplasm, probably because a molar ratio of GroE over β-lactamase was apparently below 1.
Finally, some applications of the T7 expression system were tried. The hybrid T7/SP6 RNA polymerase appeared upon IPTG induction in a soluble form. However, the hybrid RNA polymerase failed to transcribe cat gene under either T7 or SP6 promoter. Expression of cat under E. coli promoter was inhibited by 92% by T7 RNA polymerase transcription from an apposing T7 promoter.
강력한 T7 발현 체계에 의해 과잉생산된 몇몇 단백질에 대해 수용성 및 효소활성이 결정되었으며, 클로렘페니콜 아세틸전이효소 (CAT) assembly와 베타-락타메이즈 수용성에 대한 GroEL chaperone의 효과에 대한 연구가 수행 되었다.
파아지 T7 리보핵산 중합효소의 promoter 특이성과 강력한 전사능력을 바탕으로, CAT, 베타-락타메이즈, GroEL과 GroES의 선택적 과잉생산이, IPTG에 의해 유도되는 T7 리보핵산중합효소를 포함하는 대장균에서 달성 되었다.
CAT, GroES와 GroEL은 완전히 수용성이었으며, 과잉생산된 CAT은 완전한 효소활성을 지녔다. Cytoplasm에 있는 대부분의 베타-락타메이즈 전구체는 비수용성이었고 periplasm에 있는 대부분의 숙성체는 수용성이었다.
GroEL과 CAT, 베타-락타메이즈 간의 상호작용에 대한 연구가 수행되었다. 야생형 GroEL존재 하에서 CAT을 과잉생산하는 균주는 CAT의 효소활성에있어 이상을 보이지 않았으며, 열충격이나 플라스미드로부터 GroE를 과잉생산 하더라도 CAT 효소활성은 증가하지 않았다. 2개의 GroEL 돌연변이도 별효과가 없었다. 모든 경우에 CAT 효소활성은 만들어진만큼 나왔다. GroEL과 CAT이 생체 외에서 상호작용한다는 것이 밝혀졌지만, 생체 내에서는 GroEL이 CAT의 assembly에 별로 중요한 것 같지 않다.
GroEL이 생체 내외에서 베타-락타메이즈와 상호작용하는 것이 알려져 있다. 본 연구에서는 과잉생산된 GroEL 단백질이 cytoplasm에 있는 베타-락타메이즈의 비수용성 전구체형태를 수용성으로 바꾸지 못했는데, 이는 아마도 베타-락타메이즈에 대한 GroE의 몰 비가 1 보다 작기 때문인 것 같다.
마지막으로 T7 발현체계의 몇몇 응용이 시도되었다. T7과 SP6 리보핵산 중합효소로부터 만들어졌으며 SP6 promoter를 인지할 가능성이 있는 혼성 중합효소는 IPTG 유도시 수용성 형태로 나타났으며, SP6 promoter 밑에 있는 cat 유전자를 발현시키지는 않았다.
cat 유전자를 SP6 promoter 밑에, T7 promoter 반대 방향에 갖고있는 pSP6CAT로 부터의 CAT 발현은, T7 promoter를 인지하는 T7 리보핵산 중합효소 유도에 의해 92%의 방해를 받았다.
