In specific protein-DNA interactions, protein recognizes a particular DNA sequence of particular DNA structure. In this research phage RNA polymerase-promoter systems were stucied as examples of protein-DNA interactions.
First, we were interested in the structural basis for the region of T7 promoter φ10, which was known to be one of the strongest promoters in vivo and vitro. Just upstream of the gene 10 in bacteriophage T7 genome there exist expression regulatory sequences for phage T7 RNA polymerase transcription and host E. coli ribosome translation. These DNA regions have been examined for sequence-directed DNA bending. Permutation analysis of DNA fragments in these regions revealed that about 30 base pairs downstream of the translation initiation codon ATG there appears to exist a sequence-directed DNA bending. The bent region does not contain any oligo(A) tract which is known to cause bending of DNA. Calculations of the accumulated wedge angles of DNA fragments based on wedge angles revealed a good correlation between the experimental gel mobility retardation degrees and calculated DNA axis deflection angles of all the permuted DNA fragments. These data support the wedge model of DNA curvature. In order to describe real DNA axis curvature a calculation method of three dimensional tracking of DNA axis path was developed. Also, a computer program was developed to calculate the coordinates of DNA backbone and visualize three dimensional structure of DNA bending by computer graphics.
Second, in order to identify the base pairs responsible for the distinction between T7 and SP6 promoters' specific interactions with their own RNA polymerases, we made multiple base pair substitutions for phage T7 and SP6 consensus promoter sequences. Based upon comparison between the two consensus sequences and point mutation results of the T7 promoter, our target region was chosen to be the base pairs at -12, -10, -9 and -8, upstream of the transcription initiation site +1. We examined the effects of all or part of these base pair exchanges on both T7 and SP6 RNA polymerases' recognition specificities and concluded that -9 and -8 base pairs are responsible for the distinction between T7 and SP6 promoters and the other base pairs in consensus sequences are not. Also we showed that the magnitude of the effects of base substitutions on the T7 promoter strength (-9, -8, >> -12, -10) is different from that on the SP6 promoter strength (-8 > -9 > -10). At higher concentrations of NaCl(100 mM) and $MgCl_2$(20 mM), the promoter strengths of T7 and SP6 variants are more reduced than those of the wild type promoters. Especially when the base pair at -8 or -9 position of SP6 promoter is changed to the T7-specific base pair or vice versa, each promoter activity is severely reduced under high salt conditions.
Part I 의 연구에서는 T7 파아지 게놈의 유전자 10의 전사촉진제 부근의 총체적인 구조에 관해 연구하였으며 쐐기 모델에 근거한 컴퓨터 프로그램으로 분석하였다. T7 파아지 유전자 10의 T7 전사촉진제와 숙주 대장균 리보솜에 의한 번역에 필요한 염기열을 포함하는 파아지 T7 게놈의 유전자 10의 앞 부분을 순환분석한 결과 번역 개시 코돈인 ATG 아래로 30 염기쌍 떨어진 곳에서 DNA가 휘어져 있음을 알 수 있었고 이 주위에는 DNA를 휘게 하는 아데닌 소중합 염기열이 나타나지 않았다. 하지만 유전자 10의 T7 전사촉진제에서는 어떤 휘어진 DNA도 발견되지 않았고 이는 강력한 T7 전사촉진제가 DNA의 휘어짐과 연관이 없음을 알 수 있었다. 위와 같은 DNA의 휘어짐을 설명하기 위해 인접한 염기쌍 사이의 횡전 및 경사 쐐기 각도들을 이용하여 전체 DNA의 휘어진 정도를 계산한결과 겔상의 이동 속도 변화와 잘 일치하였다. 이 결과는 DNA가 각 인접 염기쌍 사이의 횡전과 경사에 의해서 휘어진다는 설을 뒷받침 하고 있다. 실제 DNA 중심축의 휘어짐을 묘사하기 위하여 삼차원 공간에서의 DNA 중심축의 행로를 추적하는 계산방법을 개발하였다. 또한 DNA 중심축의 좌표를 계산하는 컴퓨터 프로그램을 개발하였으며, 컴퓨터 그래픽을 이용하여 DNA의 삼차원 구조를 볼 수 있게 하였다.
Part II 의 연구에서는 파이지 T7과 SP6 전사촉진제의 복합 변환을 이용 하여 파아지 T7과 SP6 전사촉진제의 특이적 인식에 대해 조사하였다. T7 전사촉진제의 염기서열에서 -9(T → A)와 -8(C → G)의 변환은 SP6 RNA 중합효소가 인지하는데 필요충분하였다. 반면에 T7 전사촉진제의 염기서열에서 -10(A → T)와 -12(C → G)의 변환은 전사촉진제의 활성도를 미약하게 저해하였고 SP6 RNA 중합효소에 의해 인지되지 않았다. SP6 전사촉진제의 염기서열에서 -9 와 -8 염기쌍을 T7 전사촉진제의 염기쌍으로 변환하면 T7 RNA 중합효소에 의해 전사가 일어났고 동시에 SP6 RNA 중합효소에 의해 미약하게 인지 되었다. 반면에 전사촉진제 염기서열의 -10 (T → A,G)의 변환은 SP6 활성도에 거의 영향을 주지 않았으며 또한 T7 RNA 중합효소의 인지도 일어나지 않았다. 이와 같은 실험 결과에서 T7과 SP6 전사촉진제의 구별은 -9와 -8 염기쌍들에 의존하며 다른 염기쌍은 거의 관련하지 않았다. 또한 T7 전사촉진제의 염기쌍 변환의 영향은 (-9,-8 >>-12,-10)은 SP6 전사촉진제의 그것과는(-8 >-9>-10) 다르다고 할수있다. 높은 농도의 NaCl (100 mM)과 MgCl2 (20 mM)에서 T7과 SP6 전사촉진제의 변이형의 전사 활성도는 각각의 야생형에 비해 더 심하게 떨어졌다. 특히 T7과 SP6 전사촉진제 염기서열 -9와 -8 위치의 변환은 더욱 심하게 영향을 주었고 이는 이 염기쌍들의 인지가 다른 부분의 염기쌍에 비해 더욱 중요하게 인지되고 있음을 알 수 있다.
