Lipid hydrolysis reaction approached to complete conversion in the presence of isooctane in isooctane-water two phase. Although the lipase was unstable in organic solvent, the stability was improved by the substrate olive oil. The stabilizing effect of the substrate became less significant above 20 % olive oil.
For the continuous lipid hydrolysis in a packed-bed reactor using isooctane, Candida rugosa lipase was immobilized with DEAE-Sephadex A50, Sephadex G50, Sephadex LH20, Amberlite IRA94, and Amberlite XAD7. Among these, the ionic carrier gave higher activity yield (61 % with DEAE-Sephadex and 14 % with Amberlite IRA) than other carriers (less than 1 %) when assayed in olive oil emulsion substrate. The lipase immobilized on DEAE-Sephadex A50 showed an increased thermal stability.
In order to carry out the continuous reaction in a glass column reactor, a strategy to pack the immobilized enzyme into the reactor was developed. By using the strategy, immiscible two phase (olive oil dissolved in isooctane and buffer solution) could be evenly distributed through the packed enzyme-carrier without any surfactant supplement. The reactor performance was best with DEAE-Sephadex.
The operational stability of DEAE-Sephadex-immobilized enzyme in the reactor was influenced by initial water content of the support material. Also the types of buffer supplemented, ionic strength, pH, temperature, and substrate concentration were important operating variables for the enzyme stability. Substrate extended the operational half life logarithmically as the concentration was increased. The immobilized enzyme was much unstable above 35℃ and at 25℃.
The best operating conditions found were 20 % olive oil, 25 mM triethanolamine buffer (pH 7.0) and 30℃. Under these condition, the operational half life of the enzyme was 220 hrs at flow rate of 12.5 ml/hr (volumetric ration of substrate to buffer was 1:0.28). Still the half life was under the effect of buffer flow rate, overall feed flow rate, glycerol added, and kind of solvent used.
When the feed flow rate was reduced from 12.5 to 7.8 ml/hr, the operational half life was extended from 220 hrs to 400 hrs without any change in the productivity based on unit weight of catalyst. By adding 15 % glycerol as a stabilizer, the half life was extended from 220 hrs to 450 hrs without any significant reduction in conversion.
Meanwhile, glycerol and polyethylene glycol 300 showed strong stabilizing effect against solvent denaturation, but the effect was more significant in glycerol.
The reactor was also operable with n-hexane, and the product composition was identical regardless to the kinds of solvent used. But the operational half life in n-hexane was only about half of that in isooctane. The reaction rate in isooctane appeared to obey single substrate reaction kinetics, and an estimated order of reaction was 1.3.
The productivity of the reactor was superior to any other reactors which have been reported in literatures. The efficiency of the system based on unit of enzyme used was as great as 5 times than that of hollow fiber membrane reactor, in which no organic solvent was involved. Also it was estimated that 1 kg of dry immobilized enzyme could produce 3390 kg of fatty acids for 900 hrs of constant operation (450 hrs of half life, with 15 % glycerol supplement at 30℃).
1. 유지가수분해반응에서 유기용매 (isooctane)의 유용성
유기용매 존재하에서 반응은 완전분해에 이르는 시간이 현저히 단축되었다. 실험한 조건에서 가장 유용한 유기용매의 비율은 40 -60 % 부피비 범위였다. 유기용매는 효소를 불안정하게 하며, 그러나 기질은 이 불안정성을 어느정도 줄였다. 20 % 기질농도까지는 효소안정화 효과의 증가가 현저했으며, 그 이상의 농도에서는 큰 증가가 없었다.
2. 유기용매상에서의 유지가수분해반응을 위한 효소고정화담체의 선정
여섯 종류의 효소담체를 이용하여 고정화효소를 준비하였으며, 이온결합을 이용한 방법이 무정형흡착에 의한 방법보다 에멀션기질에서 활성수율이 높았다. 비교대상 중에서 DEAE-Sephadex에 고정화된 효소가 가장 높은 유기용매 내성을 보였다. DEAE-Sephadex A50 에 고정화된 효소는 냉동건조전에는 60 %, 후에는 12 %의 활성수율을 보였다.
3. DEAE-Sephadex-고정화효소의 특성
고정화에 의해 유기용매내성과 열안정성이 증가하였다. 10 % 올리브유 농도에서 최고속도의 1/2에 해당하는 활성을 보였다.
4. 충진식반응기에서의 연속반응을 위한 충진방법의 고안
충진과정에서 소량의 계면활성제 (AOT)를 사용하였으며, 반응 중에는 계면활성제의 공급이 필요치 않았다. 충진과정에서 고정화담체함수량을 일정하게 유지해야 반복적인 결과를 얻을수 있었다. 함수량을 조절하기위해 DEAE-Sephadex-고정화효소를 냉동건조하였고, 반응전에 일정량의 물을 넣어 수화시켰다. 수화조건은, 최종적으로, 91.0 %의 증류수가 좋았다.
5. 연속반응에서 고정화효소의 안정성에 영향을 주는 반응조건들
완충액으로서는 양이온성인 triethanolamine이 음이온성인 phosphate보다 높은 안정성을 주었다. 완충액의 농도와 pH는 25 mM triethanolamine (pH 7.0) 이 가장 좋았으며, 이 때 고정화 효소의 반감기는 220시간이었다. 기질의 농도는 안정성에 결정적으로 중요했으며, 20 % 올리브유가 반응기 운전에 적당하였다. 고정화효소의 안정성은 높은 온도에 대해 민감하며, 낮은 온도에서는 온도영향 외의 다른 요소가 있는 것으로 추정되었다. 완충용액의 유속을 낮춤으로써 글리세롤 농도는 20 % (w/v)까지 얻을 수 있었으며, 또한 효소의 활성 반감기도 늘일 수 있었다. 전체적인 유속을 줄였을 때 반감기가 늘어나는 것으로보아 열변성외 의 다른 요소가 있는 것으로 추정되었다.
6. 효소안정화를 위해 첨가된 글리세롤과 polyethylene glycol의 영향
글리세롤은, 전환율이 낮은 경우에 농도에 비례적으로 반응을 저해했으며, 전환율이 높은 경우에서는 저해정도가 두드러지지 않았다. 글리세롤은 효소의 열안정성 뿐만 아니라 유기용매내성도 크게 증가시켰다. 글리세롤과 polyethylene glycoldms 은 모두 고정화효소의 유기용매내성을 증가시켰다. 글리세롤의 안정화효과는 반응기의 조건에서 15 %에서 가장 좋았으며, 이 때 효소의 반감기는 220시간에서 450시간으로 연장되었다.
7. 연속반응기의 특성
반응속도는 단일기질 반응속도식에 따르며 반응속도차수는 1.3 이었다. 반응산물은 목적물인 지방산이 대부분이었으며, 사용된 효소의 특성이 유기용매상에서도 잘 유지되고 있음을 보여 주었다.
8. n-Hexane을 사용한 연속반응
헥산에서의 효소안정성과 반응성은 이소옥탄에서 얻어진 결과의 약 1/2에 해당하였다. 헥산에서 얻어진 반응산물은 이소옥탄의 것과 차이가 없었다.
9. 생산성의 비교
PN 값 비교에 의해, 본 연구의 반응기는 hollow fiber membrane reactor보다 약 5배 효율적으로 반응함을 알았다. 글리세롤 15 %를 첨가한 경우, 본 연구의 반응기는 지금까지 보고된 가장 높은 결과보다 약 2배의 생산성을 보였다. 위의 결과들로부터, 유기용매를 사용한 반응기가 전체적인 공정상 더 효율적일 수 있다는 가능성을 보여주었다.
