For the industrial scale production of a recombinant protein, a welldesigned medium is required, especially in the growth-associated recombinant protein production. However, it seems that bioprocess engineers as well as microbiologists do not pay attention to the nutrient deficiency in the commercially available medium.
In this research, Hepatitis B surface antigen (HBsAg)-producing recombinant yeast was cultivated to thoroughly investigate the effect of the nutrient deficiency, resulted from the use of Bacto-yeast nitrogen base without amino acids (Difco, USA), on plasmid stability and HBsAg production.
In Bacto-yeast nitrogen base without amino acids-containing medium for HBsAg-producing recombinant yeast, the nutrient deficiency, especially vitamins and trace elements, could be found. The nutrient deficiency resulted in the plasmid instability and the decrease in HBsAg production as well as the decrease in the growth yield and the maximum HBsAg production.
Using the medium shift experiment, it could be observed that the medium based on the chemically defined medium for Baker's yeast was more suitable for the cultivation of HBsAg-producing recombinant yeast. Those results were confirmed in batch cultivation and growth rate-controlled fed-batch cultivation of HBaAg-producing recombinant yeast as well.
To investigate the effect of the nutrient deficiency in Bacto-yeast nitrogen base without amino acids on plasmid stability and HBsAg production, the chemically defined medium, in which the concentrate of nine amino acids was used as a substitute for Bacto-casamino acid, was developed.
Only when Bacto-yeast nitrogen base without amino acids was added in the culture medium for HBsAg-producing recombinant yeast, did the plasmid instability and the decrease in HBsAg production occur in the repeated shaker flask culture. Among ingredients in Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, the deficiency in Fe or Zn especially resulted in the plasmid instability and the decrease in HBsAg production.
효모를 이용하여 재조합 단백질을 생산하려 할때, 상업적으로 쉽게 얻을 수 있는 배지성분 (e.g. Bacto-yeast nitrogen base without amino acids)을 이용하여 효모를 배양할 경우가 있다. 이러한 배지 성분을 사용하였을 경우, 효모가 만든 재조합 단백질이 쉽게 분해되거나 배양중 에탄올이 과량 축적되는등의 몇가지 문제점이 있는 것으로 알려져왔다.
본연구에서는 이러한 배지성분을 사용하여, B형간염 표면항원 (Hepatitis B surface antigen, HBsAg)을 생산하는 재조합 효모를 배양할 경우, 발생되어질 수 있는 문제점과 그현상에 대하여 조사하였다. 먼저, Bacto-yeast nitrogen base without amino acids에 의해서 초래 되어지는 영양성분 결핍현상에 대하여 조사하였고, 이것이 플라즈미드 안정성과 HBsAg 생산성에 어떠한 영향을 끼치는지도 살펴 보았다.
그결과 Bacto-yeast nitrogen base without amino acids에는 vitamin 과 trace element 성분이 결핍되어 있다는것을 shaker flask culture 와 fermentor 에서의 배양결과로 부터 알 수 있었고, 이것으로 인해 플라즈미드 불안정성과 HBsAg생산성이 감소되어질 수 있다는것을 알 수 있었다.
어떠한 영양성분의 결핍이 이러한 현상을 초래하는지 알기 위하여 chemically defined medium을 제조하기로 하였다. medium shift technique을 이용하여 Baker's yeast를 위해 사용하였던 배지가 가장 적합하다는 것을 알았고, 이러한 사실을 fermentor를 사용한 batch cultivation과 growth rate-controlled fed-batch cultiv ation을 통해서 확인 하였다. 또한, Bacto-casamino acid를 대체 할 수 있는 아홉개의 amino acid로 구성된 amino acid 농축액도 제조하였다.
이렇게 얻어진 chemically defined medium을 바탕으로, 영양성분 결핍이 플라즈미드 안정성과 HBsAg 생산에 어떠한 영양을 미치는지를 조사하기위하여, 일정간격으로 배양액을 transfer하는 repeated shaker flask culture 를 최고 80 세대 (Generation No.) 까지 실시하여 보았다. 그결과 Bacto-yeast nitrogen base without amino acids 가 첨가된 배지에서만, 세대수 증가에 따라 플라즈미드 안정성이 상대적으로 감소하였고, 일정 재조합 효모세포당 HBsAg 생산량 (specific HBsAg production)도 감소되었다. 그중에서도 trace element성분의 결핍이 이러한 현상을 일으켰으며, 특히 철 (Fe) 과 아연 (Zn) 의 결핍이 플라즈미드 불안정성과 HBsAg 생산량 감소를 초래하는 것으로 관찰되었다.
결론적으로, 배지내의 영양성분의 결핍이 플라즈미드 불안정성 뿐만 아니라 세포내의 HBsAg 생산량 감소를 초래하므로, 재조합 효모를 이용한 생물공정을 개발하기 위해서는 여러 조절인자중 배지성분에 대한 철저한 조사가 선행되어져야한다는 것을 알 수 있었다.
