Conidia of Aspergillus oryzae were immobilized of Ca-alginate gel beads and then incubated in a nutrient medium to yield an immobilized biocatalyst producing kojic acid. The growth behavior of mycelial cells in the matrices and the physiological properties of the immobilized biocatalyst was found to greatly affect the kojic acid production in immobilized cell cultures. Thus, three major factors investigated were as follows; the preparative conditions of making the immobilized gel beads, the environmental conditions of cultivating the immobilized cells, and then the configuration and operation of a bio-reactor.
When mycelial cells was grown to be confined within the surface of the gel beads and segregated each other by gel structure, the catalytic activity of immobilized cells was maximized. In situ growth of the immobilized cells produced kojic acid in a linear proportion during the cultivation, and then accumulated 83g/L of kojic acid in a shaking flask after 22 days. The crystal formation at the concentration above 83g/L determined the batch production period, because of the difficulty of separating the crystals from the immobilized gel particles. The immobilized cell culture repeated by replacing with fresh media decreased the production rate of kojic acid as the number of regeneration increased, and its stability was abruptly destroyed in third cultivation with the appearance of carverneous center inside the gel beads. When the immobilized cells were incubated in an airlift bioreactor with external loop, the mycelial growth in gel beads was highly dependent on fluid flow pattern which was governed by a baffle located in the bottom section of riser. The spiral fluid flow induced by the baffle resulted in the mycelial growth to be confined within the bead surface as in shaking flask culture. The dual sparging with air and pure oxygen effectively released the oxygen limitation in the immobilized cell cultures. Especially, the small variation of flow rate of pure oxygen effectively satisfied the oxygen requirement by aerobic fungal cells. Thus under an optimized culture condition, the immobilized cells produced kojic acid to a concentration of 83g/L in the modified airlift bioreactor for 11 days. When compared to that of the free mycelial fermentation, the final concentration and production rate of kojic acid increased about 4.5 and 3.0 times, respectively. In conclusion, the morphological development of mycelia inside immobilized gel beads was better than that in free suspended culture and the modified airlift bioreactor was found to be suitable to the cultivation of aerobic fungal cells immobilized into polymeric gel beads for the kojic acid production.
균사체를 형성하는 호기성 곰팡이를 이용하여 유용한 이차대사산물을 생산하는데 있어서 전통적인 액내교반배양방법을 대체할 수 있는 효율적인 신규공정을 개발하고저 하였다. 이를 위하여 생세포고정화계를 반응촉매로 선택하였으며, 목적물질의 생산을 위한 고정화제조물의 최적 배양조건을 확립하고 액내배양에 적합한 순환형 통기식생물 반응기를 새로이 제작하였다. 생세포고정화계의 고정화담체로서는 다당류로 구성된 칼슘알지네이트 겔을 사용하였으며, 호기성 균주로서 포자을 형성하는 Aspergillus oryzae을 이용하여 코오지산을 생산하는 다단계효소반응계를 연구모델로 선정하였다.
실험에 앞서 고정화조제물의 생리활성에 관계하는 변수를 분석한 결과, 담체에 포자을 고정화시킬 때 관여하는 촉매제조조건, 제조된 고정화세포의 배양시 활성에 영향을 끼치는 환경인자, 그리고 고정화제조물의 액내배양시 조업에 관련되는 인자들이 상호 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다.
고정화촉매 제조조건에 있어서 담체내에 증식되는 균체량을 제한하는 질소원의 농도가 균사체의 증식양상에 지대한 영향을 끼쳤으며, 0.275 g/L의 농도에서 균사체가 담체표면 내부에 한정되어 증식되도록 할 수 있었다. 이때, 일정한 질소원 농도에서 고정화제조물의 입경이 작을 수록 담체내부에서 균사체간의 간격이 더 벌어진 분포도를 보였다. 0.275 g/L 의 질소원 농도에서 직경이 1.0 mm 이하인 고정화제조물을 배양 하였을 때 형성된 균사체의 분포도가 코오지산 생산속도를 최대로 향상시켰다. 한편, 담체표면밖으로 증식된 균체는 배양액으로 부터 담체내부로의 물질전달을 저해하는 막을 형성하기 때문에 코오지산의 생성능을 감소시킨 것으로 판단되었다. 이러한 현상은 초기 포자농도를 증가하였을 때에도 동일하게 나타났다.
환경영향조건중 포도당의 농도는 150 g/L가 초기농도가 적합하였으며 배양중 소포제의 첨가는 코오지산의 생성능에 영향을 끼치지 못하였다. 특히, 배양배지의 초기 pH는 6.0이 적합하였고, 배양도중 pH 변화는 코오지산 생성능에 커다란 영향을 끼쳤으며 pH 증가는 코오지산 생성능력을 급격히 감소키기는 결과를 초래하였다.
촉매제조조건과 환경영향인자들이 최적화된 배지의 플라스크 배양에서 고정화생 촉매는 배양과정중 질소원이 고갈된 1.5일 부터 시간에 비례하여 코오지산을 생성하였으며, 22일 경과후 83 g/L의 코오지산을 배양액내에 축적하였다. 83 g/L의 농도에서 코오지산의 결정체가 배양액중에 나타나기 시작하였으며 배양시간이 지속될 수록 결정체 크기가 증가하여 고정화제조물로 부터 분리가 어려워졌다. 그러므로, 배양중 코오지산의 결정체가 나타나기 전 코오지산이 최고농도로 접근하였을 때 고정화생촉매의 1차 회분식 배양기간이 종료되어야 했다. 이때 고정화제조물의 촉매활성을 계속적으로 사용하기 위해 새로운 증식배지로 교체하였으나 촉매활성이 점진적으로 저하되었다. 특히 3차 회분식 배양시 담체내부에 공동이 형성되면서 코오지산 생성이 급격히 저하 되었으며 이것이 고정화담체이용을 제약하는 변수로 작용하였다.
플라스크 배양시 상기의 배양특성을 갖는 고정화제조물을 대량으로 조업하기 위해, 알지네이트 겔의 취약한 기계적강도와 호기성 균체의 산소요구도를 고려하여 탱크액내배양으로 Scale-Up이 가능한 생물반응기을 제작하였다. 이것은 기존의 순환형 통기식생물반응기을 개조한 것으로 신규제작된 생물반응기에서는 통기부에 배플(Baffle)을 설치하여 와선형유체흐름 유도하였으며, 이러한 흐름은 기존의 반응기에서 문제가 되는 솜털모양의 고정화제조물 (fluffy bioparticles)의 출현과 통기에 의한 제조물간의 마모현상을 극소화할 수 있었다. 또한 통기부의 공기주입부에 탕화유리 또는 탕화금속을 중앙에 설치하여 순수산소를 최고 0.01 vvm 정도로 공급하였을 때 배양액중 용존산소농도를 100%이상으로 유지할 수 있었다.
배플과 이중통기장치가 장착된 신규생물반응기에서 고정화조제물의 배양시 산소의 효율적 공급이 가능하였으며, 용존산소가 충분히 공급된 고정화배양계에서 11일 경과후 83 g/L의 코오지산을 제조할 수 있었다. 이러한 배양특성은 종래의 액내배양방법에서 동일균주에 의한 코오지생산능력과 비교하였을 때 코오지산의 생산속도가 약 3배 코오지산의 최종농도가 약 4.5 배 각각 증가하였다. 결론적으로 본 실험을 통하여 균사체를 형성하는 호기성미생물을 알지네이트 겔에 고정화한 조제물의 호기적 액내배양을 가능하게 하는 신규생물반응기를 제작하였으며, 순환형 통기식생물반응기에서 코오지산의 생산성을 현저히 증가시켰다. 본 실험과 더불어, 향후 보다 면밀한 Scale-up 실험과 생산공정의 개선을 통하여 종래발효생산방식을 대체할 수 있는 유용한 생산방법의 개발이 가능하리라 판단되었다.
