A new biosensor for the determination of glucose, fructose and sucrose was developed using an oxidoreductase of Zymomonas mobilis, and this biosensor was employed to construct the flow injection analysis (FIA) system.
In this study, cells of Z. mobilis were permeabilized with toluene in order to utilize thd enzymes of glucose-fructose oxidoreductase and gluconolactonase inside the intact cells. For glucose (or fructose) biosensor, biocatalytic membrane was prepared by immobilizing permeabilized cells on a gelatin mimbrane and was fixed to the pH electrode using an Oring. For sucrose biosensor, invertase and permeabilized cells were coimmobilized in the membrane using the same method. The hydrogen ion produced by the oxidoreductase reaction in the immobilized membrane was detected using the biosensor-connected microcomputer.
Optimum conditions for biosensor response were pH 6.2 and temperature 35 - 40^℃. The biosensor was highly specific for glucose and fructose; which are substrates of the glucose-fructose oxidoreductase of Z. mobilis. The calibration curves for glucose, fructose and sucrose were linear up to 5g/L, 50g/L, and 70g/L, respectively. The biosensor was stable for at least 7 day at 35℃ and the immobilized enzyme membrane was stable for more than 3 months when stored in buffer at 4℃. The results were well agreed with those obtained by a conventional analytical method.
For the elimination of the interference effect on biosensor response, the steady-state method and the fructose-addition method in the FIA system were applied. The determination of sucrose in the presence of both glucose and fructose was possible by adding 0.5 M fructose to sampling line in FIA system. In FIA system, the peak height was linearly related to fructose concentration in the range of 2-80g/L when glucose concentration was fixed at 0.3 M. The calibration curve for glucose was linear up to 8g/L when fructose concentration was fixed at 0.5 M, while sucrose was linear up to 10g/L when fructose concentration was fixed at 0.5 M. Each assay took ca. 10 min resulting in a sample throughput of 6 $h^{-1}$. The relative standard deviation of the results was less than 3.7%.
In conclusion, this system seems to be applicable for the continuous determination of glucose, fructose and sucrose in foods. FIA system could be successfully employed for on-line monitoring of glucose, fructose and sucrose in the bioprocess.
포도당(glucose) 과 과당(fructose) 을 선택적으로 측정할 수 있는 바이오센서(biosensor) 와 자당(sucrose) 측정용 바이오센서를 Zymomonas mobilis 균체에 포함되어 있는 glucose-fructose oxidoreductase 의 효소 반응을 이용하여 개발하였고, 동 바이오센서를 사용하여 포도당과 과당 그리고 자당의 농도를 자동 측정할 수 있는 Flow Injection Analysis (FIA) 시스템을 완성하였다.
Glucose-fructose oxidoreductase 의 반응은 조효소가 관여된 다단계 효소반응이기 때문에 본 연구에서는 이들 효소를 분리하지 않고 유기용매를 사용하여 균체를 투과화 시킨 다음 고정화 균체효소막을 제조하여 반응 감응부위(receptor) 로 이용하였다. 트랜스듀서(transducer) 로써는 효소 반응결과 생성되는 수소이온농도의 변화를 측정하기 위하여 pH 전극을 사용하였고, pH 전극의 수소이온 감응부위에 효소고정화 막을 1 ㎠ 가 되도록 부착시킨 다음 flow cell 내에 장착시켜 바이오센서를 제작하였다.
제작된 바이오센서의 최적 측정조건은 35 ~ 40^℃, pH 6.2 이었다. 바이오센서의 안정성은 4℃에서 보관시 3 개월간 100 % 의 응답을 보였으며, 35℃ 에서 일주일간 사용할 수 있었다. Glucose-fructose oxidoreductase 의 기질 특이성및 선택성을 알아본 결과, 같은 몰비의 mannose, xylose, galactose, ribose 의 경우는 포도당에 비해 3 ~ 5 % 의 응답 특성을 보인 반면 sorbose, acetone, pyruvate 의 응답성은 과당에 비해 거의 무시되는 결과를 보여 투과화시킨 균체효소의 포도당과 과당 두기질에 대한 선택성이 매우 뛰어남을 알 수 있었다.
포도당 농도의 측정시 시료용액내 과당의 농도를 50 g/L 로 고정하고 바이오센서의 응답특성을 알아본 결과 포도당의 경우 0 ~ 5 g/L 까지 상관도를 보인반면, 과당의 경우는 포도당의 농도를 50 g/L 로 고정시켰을경우 0 ~ 50 g/L 까지 상관도를 보여 주었다. 또한 시료용액내 존재하는 상대 고정농도에 의하여 크게 영향을 받았다.
자당측정용 바이오센서의 경우 자당의 농도를 70 g/L까지 측정할 수 있었고, 대부분의 식품중에 함유되어있는 다른 단 다당류의 영향을 조사한 결과 자당이외의 다른 단다당류에 대한 영향은 거의 무시되었는데 이것은 사용된 전이효소(invertase) 의 선택성에 기인되는 것으로 생각된다. 반면 이들 단다당류들이 자당과 같이 존재하는 경우에는 포도당과 과당의 경우가 영향을 끼친것으로 나타났으며 이중 과당에 대한 영향이 더 큼을 알 수 있었다. 이와같은 결과는 glucose-fructose oxidoreductase 의 기질친화력이 40 배이상 크게 차이가 나고 바이오센서의 측정방법이 초기속도를 측정하는 것이기 때문인 것으로 생각되었다. 따라서, 본 연구에서는 이같은 저해효과를 줄이는 방법으로 두가지 방법을 사용하였다. 첫째, 정상상태 방법을 이용하였고, 둘째, 저해효과가 큰 과당을 FIA 시스템을 이용하여 미리 고농도로 포화시켜 자당을 측정하는 시스템을 구성하였다.
개발된 바이오센서의 반응특성을 기초로 포도당과 과당 그리고 자당을 연속적으로 자동 측정할 수 있는 시스템을 완성하였다. 포도당농도의 측정시 과당의 농도변화에 대한 영향과 과당농도 측정시의 포도당의 농도 변화에 대한 영향을 glucose-fructose oxidoreductase 의 효소반응기작 (ping-pong kinetics) 으로 부터 비교 예측하여 고정시켜야 할 최적상대 농도를 결정하였고, Flow Injection Analysis (FIA) 기술을 도입하였다. FIA 바이오센서를 이용하여 완충용액 (10 mM MES buffer, pH 6.2) 의 유속을 1 mL/min, 시료의 양을 100 μL 로 하였을때 재현성있게 자동적으로 분석됨을 알 수 있었다. 시료의 분석 처리속도는 시간당 6 번이었고 상대 표준편차는 3.7 % 미만의 값을 보였다. FIA 바이오센서를 이용한 자동측정의 경우 과당의 측정시 포도당의 농도를 0.3 M 로, 포도당 측정시에는 과당의 농도를 0.5 M 이상으로 고정시킬 경우에 있어서 포도당과 과당의 저해효과 (interference effect) 를 줄일 수 있음을 알았으며, 과당의 경우 2 ~ 80 g/L, 포도당의 경우 0.2 ~ 8 g/L 까지 측정할 수 있었다. 한편, 자당측정시에도 과당의 농도를 0.5 M 로 고정시키게 되면 과당의 저해효과를 줄일 수 있는 반면 측정범위는 0.2 ~$ 10 g/L 까지로 감소하였다.
