Green fluorescent protein (GFP) is autofluorescent protein widely used for bioimaging, intracellular cell tracking and small molecule sensing. In early 2000s, split green fluorescent protein (split GFP) complementation, two (GFP1-10 OPT and GFP 11 M3) or three (GFP1-9 OPT, GFP10 M1, GFP11 M4) of split GFP fragments that reassemble in vivo and in vitro, was also successfully demonstrated. And split GFP systems were utilized in many research fields as a sensor to assay solubility of target protein, protein-protein interaction and engineering novel protein scaffolds. The typical bacterial host for protein expression, Escherichia coli, is generally used as the host to develop these fluorescent reporters and also it can be engineered in itself by using these fluorescent protein-based biosensors. In this regard, the more sophisticate tools working in E. coli are essential to engineer peptide pairs or E. coli itself. In this study, two reporter systems working respectively in each of E. coli compartment were developed by using split GFP complementation. First, the split GFP reporter system acting in periplasm was developed for the purpose of signal recognition particle pathway (SRP pathway) engineering with introduction of several secretory pathways and cytoplasmic protein degradation system. Moreover, the cytoplasmic tripartite split GFP system was reconstructed, so it can emit fluorescence in sufficient intensities to be detected by fluorescence activated cell sorter (FACS). Then, the reconstructed tripartite split GFP system was evaluated with introduction of several affinity pairs showing different affinities (from 1μM to 1nM), and it was also confirmed that this system has ability to detect a strong affinity pair of which Kd value is approximately 1nM. Here, along with the previously confirmed systems, it is expected that reconstructed tripartite split GFP system can be applied to engineer peptide pairs with remarkably high affinity below 1nM in $K_d$ value.
녹색형광단백질은 대표적인 자가형광단백질로서 바이오 이미징 및 세포 내부 감시 및 작은 분자의 감지 등 여러 분야에 응용되어 왔다. 2000년대 이후에는 형광단백질 기반 보고 및 감지 시스템의 연장선으로서 스플릿 녹색형광단백질이 성공적으로 개량되었다. 스플릿 녹색형광단백질은 두 조각 (GFP1-10 OPT, GFP11 M3) 혹은 세 조각(GFP1-9 OPT, GFP10 M1, GFP11 M4)으로 나뉘어진 후 세포 내 공간 및 세포 외에서 다시 만나 결합할 수 있도록 개량된 단백질이며, 이 시스템을 통해 단백질의 수용성 혹은 단백질 간 상호작용 분석 및 새로운 골격 단백질 개량 연구가 최근 진행되었다. 단백질 발현을 위한 대표적인 숙주 미생물로서 대장균은 자가형광단백질 개량 연구의 주요 숙주로 이용되어 왔으며, 때로는 개량된 형광단백질 기반 감지 시스템을 통해 대장균 그 자체가 목적에 맞게 개량되기도 했다. 이러한 측면에서, 연구 목적에 맞는 단백질 쌍의 개량 및 혹은 대장균 자체의 개량에 보다 용이하게 적용될 수 있는 보고 단백질 시스템의 개발이 필요하며, 본 논문에서는 대장균의 각 구획 별로 작용 가능한 두 가지 형광 기반 보고 시스템을 스플릿 녹색형광단백질을 이용하여 구축하였다. 우선, 신호 인식 입자 경로 (signal recognition particle pathway) 개량에 적용하기 위한 대장균의 주변세포질에서 작용 가능한 두 조각 스플릿 녹색형광단백질 시스템을 개량하였다. 주변세포질로 스플릿 녹색형광단백질을 분비하기 위해 신호 펩타이드(signal peptide)가 도입되었으며, 본 보고 시스템을 보다 정교화하기 위해 프로테아제 기반의 세포질 내 단백질 분해 시스템 또한 추가하여 주변세포질에서 작용하는 스플릿 녹색형광단백질 보고 시스템을 최종 구축하였다. 이러한 전략으로 구축된 주변세포질 보고 단백질 시스템은 분비 경로 개량 연구에 형광 기반 보고 시스템으로서 적절히 적용될 수 있을 것이다. 또한, 본 논문에서는 세포질에서 작용하는 세 조각 스플릿 녹색형광단백질 보고 시스템을 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter: FACS)에서 충분히 분석 가능한 수준의 형광을 발하도록 발현 시스템을 재정비하였다. 세 조각 스플릿 녹색형광단백질 보고 시스템은 재정비된 후 서로 다른 수준의 친화력을 가지는 여러가지 단백질-리간드 짝의 도입을 통해 그 감도가 확인되었으며, 해당 시스템은 상당한 수준의 친화력이라 할 수 있는$K_d$값 1nM 수준의 단백질-리간드 짝을 감지하였다. 이는 높은 수준의 친화력을 가지는 단백질 간 상호작용 연구에 유용히 적용될 가능성을 보여주며, 현저한 수준의 단백질 쌍 혹은 펩타이드 쌍의 개량 연구를 수행할 수 있는 훌륭한 보고 단백질 시스템이 될 것이다.
