Cellular DNA suffers from a wide range of damages caused by UV light and chemical mutagens. An increasing number of examples that demonstrate the correlation between DNA repairing and disease prevention have been documented. Base excision repair (BER) that protects cells from nucleotide base damage has been considered one of the major pathways to repair cellular DNA. Thus, it is of great importance to develop assays for the DNA repair enzymes which play critical roles in the cell.
In this study, by using uracil-DNA glycosylase as model enzyme, a novel, label-free, fluorescent assay for the accurate determination of BER enzyme activity has been developed by employing abasic site-containing duplex DNA and a nucleobase-specific fluorescent ligand, 2-amino-5, 6, 7-trimethyl-1, 8-naphthyridine (ATMND). ATMND as an extrinsic fluorophore can be quenched in the cytosine opposite abasic site of duplex DNA by stacking interaction with the flanking nucleobases. Our assay relies on the strategy that UDG-catalyze the removal of uracil bases from duplex DNA, which leads to the releasing of ATMND. Consequently, the released ATMND emits a high fluorescence signal. Using this new strategy, UDG is successfully analyzed with a high selectivity and sensitivity. In addition, this assay shows the potential that it can be utilized as a promising strategy for the investigation of UDG inhibitors. We strongly expect that a broad range of other enzymatic assays can be devised by using this approach.
DNA 는 광범위한 범위의 물리적 화학적 물질에 의해서 손상된다고 밝혀졌다. 유전자의 보존은 암과 세포 노화를 방지하기 위한 필수적인 요소이다. DNA 복구 시스템은 유전자를 완전하게 유지하는데 있어 중대한 역할을 한다. DNA 복원과 질병예방 사이의 상관관계를 입증하는 사례가 증가하고 있는 것으로 보고되어 왔다. 뉴클레오티드 염기 손상으로부터 세포를 보호하는 염기 절단 보수(BER)는 세포의 DNA를 보수하는 주요 경로 중 하나 이다. BER 활성의 검출을 위한 기존의 방법은 시간 소모가 크고, 간접적이고, 다루기 어렵고, 둔감하고, 노동집약적이며 인체에 해롭다. 따라서 BER 효소활성 분석을 위한 민감하고, 편리하고, 경제적인 기술의 개발에 대한 필요성이 대두되었다.
이번 연구를 통해, 무염기를 갖는 이중가닥 DNA 와 무염기 특이적인 형광 리간드, 2-amino-5, 6, 7-trimethyl-1, 8-naphthyridine(ATMND)를 이용해 uracil-DNA glycosylase를 모델 효소로 하는 새로운, 무표지, 형광 기반 BER 효소 활성 검출법을 개발하였다. ATMND 는 외부 형광 물질로서, 이중가닥 DNA cytosine 맞은편에 있는 무염기 부위에 위치하여, 주변의 염기들과의 base-stacking 상호작용에 의해 형광이 억제된다. 우리가 개발한 분석법은 UDG 에 의한 이중가닥 DNA 로부터의 uracil 염기의 방출과 이 결과로 야기되는 ATMND 의 방출에 기반한다. 결과적으로, 방출된 ATMND는 높은 형광 신호를 낸다. 이 저비용 분석은 간단하고, 무 표지이며 매우 특이적이다. 이 분석은 어떠한 증폭과정 없이, 0.023U/ml의 LOD를 갖는다. 이 분석의 민감도는 최근에 보고된 여러 DNA 기반 UDG 활성 검출 방법들과 비슷한 수준을 보인다. 이 분석은 BER 효소활성 검출에 쓰일 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 저해제를 체외에서 고효율로 가려내는데 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 접근방식을 이용해 다양한 효소활성 분석도 고안되어질 수 있을 것으로 매우 기대한다. 이 분석법은 임상진단에 적용될 수 있는 엄청난 잠재력을 갖는다.
