Part I. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Bipotent Nephron Progenitor Cells in a Serum and Feeder Free System
Kidney disease is emerging as a critical medical problem worldwide. Because of limited treatment options for the damaged kidney, stem cell treatment is becoming an alternative therapeutic approach. Of many possible human stem cell sources, pluripotent stem cells are most attractive due to their self-renewal and pluripotent capacity. However, little is known about the derivation of renal lineage cells from human pluripotent stem cells (hPSCs). In this study, I developed a novel protocol for differentiation of nephron progenitor cells (NPCs) from hPSCs in a chemically defined serum- and feeder-free system. I designed step-wise protocol for differentiation of human pluripotent stem cells toward primitive streak, intermediate mesoderm and NPCs by recapitulating normal nephrogenesis. After modification of culture period and concentration of exogenous factors, hPSCs can differentiate into NPCs that markedly expressed specific marker genes such as SIX2, WT1, PAX2 and SALL1 in transcription and protein levels. Moreover, NPCs possess the potential of bidirectional differentiation into both renal tubular epithelial cells and glomerular podocytes in defined culture conditions. They can also form in vitro tubule-like structures in three dimensional culture systems. Thus, this novel protocol for hPSCs differentiation into NPCs can be useful for producing alternative sources of cell replacement therapy and disease modeling for human kidney diseases.
Part II. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Bladder Urothelium in a Serum and Feeder Free System
Human stem cells have been considered promising cell sources for bladder regeneration. Among several possible sources of human stem cells, pluripotent stem cells are most fascinating because they can differentiate into any of the cell types in the body and exhibit unlimited proliferation in vitro. For cell therapy, pluripotent stem cells should be differentiated into a specific cell type prior to transfer to the patient to reduce the risk of uncontrolled differentiation. The aim of this study was to develop a novel protocol for differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into bladder urothelium in a chemically defined serum-free monolayer culture system. Based on the developmental processes that form the bladder urothelium, a step-wise approach was used for differentiation of hPSCs into bladder urothelium. Initially, hPSCs differentiated into DE cells which were confirmed by analysis of DE marker genes expression. DE cells did not express mesodermal or ectodermal genes. hPSC-derived DE cells were further differentiated into bladder urothelium under a serum-free medium supplemented with retinoic acid (RA). The hPSC-derived urothelial cells showed strong expression of urothelial marker genes, including UROPLAKIN Ib, II, IIIa and CK20, as well as CY-TOKERATIN 7 and FOXA1 in transcription levels. These urothelial cells also expressed UROPLAKIN II and CK8/18 in protein levels. However, they did not express the marker genes of smooth muscle cells as well as other common endoderm-derived cell types (liver and intestine). In summary, I sequentially differentiated hPSCs into DE and bladder urothelium under serum- and feeder-free conditions in this study. This novel protocol will be useful for producing alternative cell sources for bladder regeneration, and in vitro tools for studying the diseases of the human bladder urothelium at the molecular and cellular levels.
최근 수년간 줄기세포를 이용한 세포치료는 재생의학 분야의 새로운 흐름을 주도하고 있으며, 특히 신장, 방광 등의 비뇨기계통의 장기처럼 손상 후 재생이 어려운 경우 임상 적용의 필요성이 크다. 여러가지 줄기세포 종류 중 인간배아 줄기세포 및 인간 역분화 줄기세포와 같은 인간 전능성 줄기세포는 인체 내 어떠한 세포로도 분화가 가능한 특성을 가지고 있어 그 효용 가치가 가장 기대된다. 줄기세포를 이용한 신장세포 및 방광요로상피세포로의 분화는 주로 마우스 유래의 배아줄기세포 및 역분화 줄기세포에서 이루어졌으며, 인간 전분화능 줄기세포를 이용한 연구는 아직 미진한 실정이다. 마우스 줄기세포를 이용한 연구가 발생학적 관점에서 신장 또는 방광의 발달에 중요한 정보를 제공할 수 있지만, 마우스와 사람 간의 종의 차이 (species differences)로 인한 한계가 존재한다. 한편, 신부전 치료에 효과가 있을 것으로 기대되는 네프론 전구세포의 경우 태아 및 성인 신장에서 추출한 태아 또는 성체 신장 전구세포가 주로 연구되었으며, 인간배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포를 이용한 신장 또는 네프론 전구세포 분화 방법에 대한 연구는 거의 보고된 바가 없다. 방광요로상피세포로의 분화 역시 중간엽 줄기세포나 지방유래 줄기세포 등을 통한 분화 유도가 보고된 바가 있으나, 인간배아 및 역분화 줄기세포에서의 직접 분화는 아직 연구가 미진한 상황이다. 배아 또는 역분화 줄기세포를 이용하여 방광요로상피세포로의 분화를 보고한 연구팀 역시 화학적으로 정제된 환경에서 분화 유도를 한 것이 아니라 지지세포 (feeder cells)을 이용한 상호배양 (co-culture) 방식을 사용하였다. 지지세포 또는 혈청이 함유된 배지를 사용하는 경우 이들에서 나타나는 예측할 수 없는 수많은 인자로 인한 위험성을 배제할 수 없으므로, 화학적으로 완전히 정제된, 즉, 지지세포 및 혈청을 사용하지 않는 분화 기술의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구의 목적은 인간 전분화능 줄기세포를 이용하여 혈청 배지 및 지지세포가 없는 환경에서 각종 성장인자 및 시토카인을 처리함으로써 네프론 전구세포로의 분화 및 방광요로상피세포를 효율적으로 유도할 수 있는 새로운 방법을 개발하는 것이다. 네프론 전구세포의 경우 정상 신장 발달 과정에 기초하여, 인간 전분화능 줄기세포로부터 원시선조 (primitive streak), 중간 중배엽 (intermediate mesoderm) 및 네프론 전구세포 (nephron progenitors)로 이어지는 단계별 분화를 유도하였다. 방광 요로상피세포의 경우 정상 방광요로상피세포의 발달 과정에 따라, 인간 전분화능 줄기세포로부터 내배엽 (definitive endoderm)을 거쳐 방광요로상피세포로 이어지는 단계별 분화 방식을 적용하였다. 각 단계별로 주요 유전자의 발현을 실시간 중합효소 연쇄반응 및 면역 형광염색을 통해 확인한 후에, 다음 단계의 유도를 진행하였다. 최종적으로 얻어진 네프론 전구세포 및 방광요로상피세포의 경우 유전자 및 단백질 수준에서 각 세포의 특이적 마커의 발현량이 증가함을 확인하였다. 특히, 네프론 전구세포의 경우 기능적 분석을 위해 시험관 조건 (in vitro)에서 네프론 전구세포의 신장 관상피 세포 및 포도체로의 이분화능을 확인하였다. 또한 네프론 전구세포를 마트리젤과 혼합하여 누드 마우스의 피하조직에 주입하였을 경우, 관 모양의 조직 형성이 일어나며, 이러한 관 모양 조직들이 신장 특이적 마커들을 발현하고 있음을 면역 염색을 통해 확인하였다. 본 연구를 통한 인간 전능성 줄기세포로부터 네프론 전구세포 및 방광요로상피세포로 분화시키는 새로운 방법의 개발은 추후 세포 치료의 새로운 재료로 이용할 수 있을 뿐 아니라, 역분화 줄기세포 기술을 접목한 각종 신장 및 방광질환에서의 질환 모델링 및 신약 스크리닝에도 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
