Genome stability and integrity of a host strain are critical for the production of high quali-ty bioproducts from industrial microorganisms. However, the genomes of microorgan-isms are littered with transposable elements (TEs) called “jumping genes”, which are re-combinogenic factor causing genome instability and genetic variations. These elements cause many genetic rearrangements such as inversion, deletion, duplication and transposi-tion, thus causing adverse effects such as production of unwanted by-products and non-homogeneous products and masking expression of genes. To minimize these harmful ef-fects of TEs of Escherichia coli, we developed a TEs-free strain, in which all of TEs in-cluding insertion sequences (IS), transposons, phages and cryptic phages, were removed from E. coli MG1655 genome by a rapid markerless deletion system. Here, we compared the expression profiles of recombinant protein such as tumor necrosis factor-related apop-tosis-inducing ligand (TRAIL) and bone morphogenetic protein-2 (BMP2) in MG1655 and TEs-free strain. The hopping of ISs (IS1, IS3 or IS5) into the TRAIL and BMP2 genes oc-curred at the rate of $~10^{-8}/gene/h$ in MG1655 whereas no IS hopping was observed in TEs-free strain. Even though IS hopping occurred very rarely $(10^{-8} /gene/h)$, the IS-inserted TRAIL and BMP2 clones became dominant (~52 % of total population) in 28 h after fer-mentation because of its rapid growth, significantly reducing production of recombinant therapeutic proteins in batch fermentation. Our observation clearly indicates that TEs jumping is detrimental to the production of recombinant enzymes, strongly emphasizing the necessity of developing a TEs-free host strain. Thus, our TEs-free strain will be use-ful as a robust and suitable host for the production of recombinant therapeutic proteins.
방대한 양의 유전체 정보가 축적된 포스트 게놈 시대 이후로 산업에 적용 가능한 새로운 균주 제조 기술 개발과 그것의 효율적인 활용이 전세계적인 관심사로 대두되었다. 유전체 재설계에 의한 강력한 생물 산업용 균주 개발은 방대한 미생물 유전체 정보를 비교 분석하여, 중요한 미생물의 유전적 기능과 특성을 이해하고 장점을 극대화하여 이를 산업화 하는데 필수적인 연구 분야이다. 이는 낮은 효율성과 경제성 때문에 실제 산업화에 실패했던 과거의 유전체 및 균주 활용 방법과는 다르게 실제로 미생물 유래 바이오 물질 생산하여 산업에 널리 쓰일 수 있을 것이며 유전체의 응용분야와 기초학문 분야에도 사용될 수 있을 것이다. 현재 산업에 사용하기 위한 균주의 유전체 연구와 활용에는 대장균이 platform strain으로 많이 활용 되고 있다. 이는 대장균이 병원성을 나타내지 않고 유전체와 유전자를 engineering 할 수 있는 공학적 기술이 개발되어 유전체 재설계뿐 만 아니라 실험적 검증 및 분석이 가장 용이한 균주이기 때문이다.
본 연구에서는 현재 생명공학 산업에서 가장 널리 이용되고 있는 산업용 균주인 대장균 유전체로부터 의약용 단백질 생산에 불필요한 유전자를 제거하여 불필요한 전이성 유전자들이 제거된 균주 (TEs-free strain)를 제작하였다. 의약용 단백질 산업에서 호스트로 사용되는 균주 게놈의 안정성은 매우 중요한 요소이다. 박테리아의 게놈상에서 insertion sequence (ISs)와 같이 점핑 유전자로 알려진 전이성 유전자들은 수많은 유전적 변이 (insertion, deletion duplication excision 등)를 야기하며 의약용 단백질과 플라스미드의 안정성을 유지할 수 없게 만든다. 이러한 부작용을 최소화 하기 위해 우리는 ISs, transposons, recombination hot spots, phage, prophage등의 유전자를 대장균 MG1655로부터 제거 하였다. 전이성 유전자가 제거된 균주의 효과를 확인하기 위해서 새로운 cancer agent로 연구 되고 있는 Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)과 Bone morphogenetic protein-2 (BMP2)를 MG1655와 TEs-free 균주에서 발현했다. MG1655에서 IS1, IS3, 혹은 IS5 는 약 $~10^{-8}/gene/h$ 의 확률로 각각의 유전자 안에 삽입 되는 것을 확인 했으나 TEs-free 균주에서는 발견되지 않았다. 비록 ISs의 점핑이 낮은 확률로 발생하지만 $(10^{-8} /gene/h)$ IS가 삽입 되어있는 TRAIL과 BMP2 유전자를 가진 균주들은 28시간 발효과정중 약 52%의 개체수 까지 증가하며 우점종이 되는 것을 확인 했다. 이는 IS가 삽입된 유전자가 발현 되지 않고 성장에 에너지를 사용하게 함으로써 growth advantage를 가지게 되고 심각한 단백질 생산량 저하를 가져오게 한다. 이와 같은 결과는 개발된 TEs-free 균주가 산업용 host 균주로써 매우 중요하게 사용 될 수 있음을 보여준다
